原 文 作 者:Francois Jaisel´,Olivier Merdy,Tom Meyns,Vale´rie Decens,Sjouke Van Poucke,Guillaume Perreul,Benoit Boivent,Han Smits,Alberto Aguilera,Laurent Fischer,Chtherine Charreyre
(1.Marial SAS, 里 昂, 法 国;2.Merial Belgium,Diegem, 比 利 时;3.Merial Velserboek, 荷 兰;4.Merial SAS Ancenis,法国;5.Merial 北欧)
花象柏1(编译),欧伟业2,肖焕星2,杨茂春2(校稿)
(1.江西农业大学,江西 南昌 330000;2.浙江美保龙生物技术有限公司,浙江 金华 321000)
本研究对猪I 型PRRS 活疫苗(MLV)免疫接种和MLV 与灭活疫苗(KV)的组合免疫接种的免疫应答进行了比较。实验设计如下(如表1),将32 头小猪随机分成4 组,每组8 头。A 组、B 组、C 组各组猪于1.5 月龄时注射I 型PRRS 弱毒疫苗,D 组为不注射疫苗的对照组。在猪4.5 月龄时,A 组注射第2 次I 型PRRS 弱毒疫苗,B 组和C 组注射I型PRRS 灭活疫苗(PROGRESSIS,法国Marial 公司生产,2 mL,肌肉注射)。在猪5.5 月龄时,C 组再注射一次同型同剂量的灭活苗。在猪6.5 月龄时,用I 型PRRSV 2749 毒株鼻内接种(与欧洲型LELYSTED同源性为99%)对32 只猪攻毒,剂量为2 mL 106TCID50病毒培养液。检测各组免疫后ELISA 抗体,中和抗体(NA)和细胞免疫(CMI)水平,并在攻毒后测定病毒血症。
检测各组猪免疫后ELISA 抗体,结果显示第二次用弱毒苗和用灭活苗免疫差异不大。
检测各组猪4.5 月龄、5.5 月龄、6.5 月龄和攻毒后14 d 的中和抗体阳性率和平均滴度。结果显示加强两次灭活疫苗接种的C 组在攻毒后14 d 中和抗体水平明显高于未注射灭活苗的A 组,而接受一次灭活苗注射的B 组,其中和抗体滴度介于C 组和A 组之间。如表2。
测定各组猪每个时间点的INF-γ 水平,如图1 加强两次灭活疫苗的C 组在攻毒后INF-γ 快速升高,在攻毒后7 d 达到峰值显著高于其他组。
荷兰一个300 头母猪场在母猪妊娠第90 天对母猪额外增加灭活疫苗接种,评估仔猪PRRS 抗体滴度的增加以及其在保育期对PRRSV 的保护率。母猪在分娩后第6 天跟胎注射一次I 型猪蓝耳病弱毒疫苗,但保育猪长时间存在PRRSV感染的问题。之后免疫程序改变为:保留哺乳期弱毒疫苗的免疫,先给母猪连续2 次免疫弱毒疫苗,间隔为3 周,接着在母猪怀孕90 d 时,注射一次灭活疫苗(PROGRESSIS)。在所生小猪4、7 和10 周龄时,抽取3 窝小猪的血清,用IDEXX ElISA 试剂盒测定其抗猪蓝耳病的抗体滴度,并用多重PCR检测其口腔液中的呼吸道病原。母猪在免疫灭活疫苗前,血清学检测证实5 ~10 周龄的小猪存在PRRSV的感染。应用灭活苗后,小猪血清中抗猪蓝耳病的母源抗体滴度更高,维持时间更长,直到8 周龄其母源抗体尚未消失。口腔液PRRSV 的检测除1 窝在10 周龄时检测为阳性外,其余均为阴性。如此免疫方法连续检测了3 批分娩的小猪血清,其猪蓝耳病抗体的检测结果都一样。结果表明母猪于分娩前接种一次灭活苗确实能延长小猪血清猪蓝耳病母源抗体维持的时间,从而对抗小猪的早期PRRSV 的感染。
表1 实验分组
表2 各组猪免疫后不同时间中和抗体阳性比例及抗体值
图1 免疫后各组各时间段INF-γ 水平
一个1 200 头母猪的猪场,具有5 条生产线。母猪用I 型猪蓝耳病弱毒疫苗,每年3 次。2012 年1 月,出现严重的猪蓝耳病症状,母猪表现为早产、产死胎和弱仔。产房小猪死亡率达4.5%,抗菌药物用量增加。猪血清ELISA(IDEXX)检测,证实PRRSV 感染。在3 ~7 周龄的小猪也检出PRRSV 感染。之后对母猪PRRS 疫苗作了调整,改为怀孕60 d注射I 型PRRS 弱毒苗,怀孕90 d 注射一次灭活苗(PROGRESSIS)。到2012 年11 月,母猪和小猪仍能检出PRRSV,到2013 年10 月,母猪PRRS 抗体差异稳定,小猪S/P 比例在断奶时仍然较低。到2013 年末,断奶小猪死亡率降至2%左右,母猪和小猪PRRSV 的循环明显稳定。结果再次表明,母猪于怀孕90 d 时注射一次灭活苗确实能增加小猪母源PRRS 抗体的水平,控制PRRSV 的循环,稳定整个猪群。
在法国布列塔尼地区有一个400头母猪的PRRS 阳性猪场,该场有5栋分娩舍,每栋可容纳80 头母猪。母猪通常在哺乳时注射I 型PRRS 弱毒疫苗。哺乳期未见有猪蓝耳病症状。小猪在断奶时注射支原体疫苗,不接种PRRS 疫苗。保育和育肥期猪呼吸道疾病多发,需要使用抗菌药物。2013 年12 月,通过PCR 检测PRRSV 抗原和ELISA(IDEXX)检测抗体证实了保育猪PRRSV 的感染。2014 年1 月,其中一条生产线的怀孕母猪在怀孕90 d 时接种了一次PRRS 灭 活 苗(PROGRESSIS)。对这些母猪产下的10 头小猪口腔液采用PCR 检测其PRRSV 的感染情况,并于8、12 和16 周龄时采血检查其PRRSV 抗体情况(用ELISA方法)。这些应用了灭活苗母猪的后代直至出栏都未见任何呼吸道症状。ELISA 检测除1 头仔猪PRRS 抗体在8 周龄血检中S/P 为0.66 外,其余仔猪在8 和12 周全为阴性。血清和口腔液样品,到仔猪16 周龄的样品才呈现ELISA 阳性结果,表明仔猪断奶后16 周才感染PRRSV 转阳。在2014 年2 月,母猪又按原来的免疫计划,即只在产后6 d 注射弱毒疫苗,哺乳小猪再次出现呼吸道症状,表明了早期的PRRSV 感染。2014 年6 月,怀孕母猪于妊娠90 d 龄时再次接种一次灭活苗,猪群的呼吸道症状再次减少。2014 年10 月,口腔液样显示PRRS 母源抗体持续至10周龄。直到12 周龄,PRRSV 感染仍呈阴性。这一例子表明,母猪产前3周左右注射灭活疫苗是控制猪群早期感染PRRSV 的有效措施。
丹麦一个1 000 头母猪的猪场,在4 ~10 周龄的猪群中存在呼吸道症状,采用PCR 检测4 周龄前猪支气管-肺泡的灌洗液(BAL)证实为PRRSV 感染。小猪未接种PRRS 疫苗,母猪免疫用I 型PRRS 弱毒苗,程序为怀孕60 d 和产后6 d。后改为怀孕60 d 用弱毒苗和90 d 用灭活苗(PROGRESSIS)。如此实行一年后,对4 ~10 周龄的小猪收集BAL 液用PCR 检测PRRSV;6 头母猪于产前4、3 和1 周采血进行ELISA 检测。该6头母猪每头所产生的小猪随机取3 头于4、7 和10 周龄时采血进行PCR 和ELISA 检测。PCR 检测表明,PRRSV在BAL 液和血清中的检出已由以前的4 周向后推至10 周(即怀孕90 d 用了灭活苗后)。断奶小猪的临床症状明显改善。母猪在应用灭活苗前,血清中抗PRRSV 抗体滴度在产前3 ~4 周是减少的,而在应用灭活苗以后,母猪的上述抗体滴度明显增加。猪场生产成绩也明显提高:每头母猪每年断奶仔猪从28.2 头提高至31 头,产活仔数从32.2 头提高至34.7 头,断奶后日增重从每天302 g 增加至320 g,断奶后仔猪死亡率从4.7%下降至0.8%。该案例说明:母猪在怀孕后期接种一次PRRS 灭活苗,断奶后小猪能推迟PRRSV 的感染,提高猪群的生产性能,减轻PRRSV 感染的症状。
据Boivent 等(2016)的调查,在法国养猪最密集地区的一些养猪场,商品猪群经常出现PRRS 疫情。各猪场的PRRS 免疫程序不同,有的先用I 型PRRS 弱毒苗作一次基础免疫,在分娩后6 d 再加强免疫一次;有的在怀孕60 d 用弱毒苗免疫一次;有的用弱毒苗每4 个月一次。后来,这些猪场都在母猪怀孕90 d 时增加一次灭活疫苗的免疫。为比较灭活苗应用前后母猪所产小猪PRRSV 的感染情况(用RT-PCR 法)和小猪体内抗PRRSV 抗体的情况(用Idexx 试剂盒),在8 个猪场,每个猪场采取14头小猪不同阶段的口腔液,共81 份样品。检测结果表明,母猪在应用灭活苗前,其所产小猪在5 ~7 周龄即能测出20%以上样品PRRSV 阳性,以后PRRSV 阳性率进一步快速升高。在母猪应用灭活苗后,其所产小猪至14 周龄才有11/23 的小猪检出PRRSV呈阳性。小猪断奶后,具有较高的抗PRRSV 抗体,直到10 ~16 周龄,其抗体水平才缓慢下降。
结论:用PRRS 弱毒疫苗免疫的母猪,在怀孕后期注射一次PRRS 灭活疫苗,其所产小猪能推迟对PRRSV 的感染。
美国FA Zuckermann, MUZ 博士 研究证明PRRSV 弱毒疫苗对异源PRRSV 攻毒只有部分保护。猪感染PRRS 野毒或接种PRRS 弱毒疫苗诱导产生大量无中和能力的抗体,在感染4周后产生T 细胞介导的PRRSV 特异性淋巴细胞增生性应答,持续9 ~14 周。在这期间,产生有限数量的分泌IFN-γ细胞,有保护作用。重复接种弱毒疫苗的猪加强接种并不会引起对PRRSV的T 细胞应答增加,而且与未接种过同样疫苗的猪相比反而受到抑制。
PRRSV 先天性免疫应答,引起特异性的细胞介导免疫延迟,是因为缺乏对病毒感染足够的IFN-γ 应答。急性感染PRRSV 的猪肺中产生的IFN-γ 几乎检测不到,PRRSV 诱导产生的IFN-γ 是呼吸道冠状病毒诱导产生的0.6%。
提高对PRRS 保护性免疫刺激的方法:PRRSV 活疫苗与灭活疫苗联合使用可增加宿主对PRRSV 的IFN-γ应答,但体液免疫应答没有明显变化。只有用猪肺巨噬细胞生产的PRRSV弱毒疫苗才能提高IFN-γ 的应答,用Marc-145 细胞生产的不能被提高。所以用PRRSV 活疫苗与灭活疫苗联合使用可增加宿主对PRRSV 的IFN-γ应答,提高细胞免疫水平。