芥菜TCP转录因子家族全基因组鉴定及表达分析

李坤杰，谭杉杉，孙 勃，饶 丹，何 琦，闵爱玲，李梦瑶

（四川农业大学园艺学院，成都 611130）

转录因子（transcription factor），是一类能够识别并结合特定序列DNA 结合域的启动子区域、并以此调节新陈代谢或发育过程的蛋白质[1]。TCP 是植物特有的转录因子家族之一，其基因的命名来自3 个不同物种的4 个基因的首字母缩写，分别是玉米 TB1、金鱼草 CYC、水稻 PCF1 和 PCF2[2-4]。这 4 个基因所编码的蛋白质共同点是在其N 末端都含有一段高度保守的60 个左右的氨基酸残基，又名TCP结构域，能够形成一个非典型的碱性-螺旋-环-螺旋的结构[5-6]。根据TCP 结构域的氨基酸序列差异，该家族可分为两个亚组：ClassⅠ和ClassⅡ，ClassⅠ又名PCF，ClassⅡ还可继续分为两个小组，分别为CIN 和 CYC/TB1[7]。

自1999年来，TCP 家族作为新的转录因子家族出现，对其功能的探索在不断加深。在TCP 命名的4个基因中，对基因的功能研究均显示它们参与了植物的生长发育。玉米TB1 抑制了侧生分生组织和雄花原基发育[2]；金鱼草Cyc 基因调控花的对称发育[3]；水稻PCFI 和PCF2 基因促进了分生组织中PCAN基因启动子的特异性表达[4]。最近研究表明，TCP 转录因子除了参与植物的生长发育，还与植物的免疫调控及响应逆境胁迫息息相关：CIN-like TCP 与植物抵御病原菌入侵的免疫反应有关[8]；木薯MeTCP4基因在干旱及低温胁迫下表达受到抑制[9]；水曲柳TCP4 响应寒冷、盐、干旱等非生物胁迫以及激素信号，说明其参与了植物逆境胁迫的调控[10]。

芥菜（Brassica juncea）是十字花科芸薹属重要的园艺作物。茎瘤芥是芥菜的一个茎用变种，其瘤茎在生长发育过程中，叶柄基部发生变态，形成1～5 个瘤状凸起，并随茎膨大而横向膨大[11]。茎瘤芥的瘤茎生长发育过程非常复杂，涉及到形态、生理、生化和遗传等多方面的变化。目前，对茎瘤芥的瘤茎膨大的机理研究尚不深入，尤其与茎膨大相关的功能基因的研究报道较少。TCP 家族基因广泛参与了植株的生长发育，目前的研究主要集中于拟南芥、水稻、玉米等植物中，对芥菜TCP 家族研究尚未见报道。

本研究，通过生物信息学方法，对芥菜基因组数据库进行检索，筛选并鉴定芥菜所有的TCP基因，并对这些基因的理化性质、结构特征以及基因表达等进行分析，以期为今后进一步研究芥菜TCP 基因的功能及参与茎膨大的调控机制提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 芥菜TCP转录因子家族成员的检索与鉴定

从 Pfam 数据库（http：//pfam.xfam.org/）下载 TCP家族模块序列（PF03634），从芥菜基因组数据库（http：//brassicadb.org/）下载芥菜蛋白序列，利用HMMER 软件从芥菜基因组序列中检索TCP 蛋白序列[12]。将候选蛋白进一步提交至NCBI-CDD 和Pfam（http：//pfam.xfam.org/）进行 TCP 结构域的确认。利用 ExPASy 网站（http：//web.expasy.org/protparam/）对确认的TCP 蛋白序列进行蛋白质分子量、等电点和氨基酸大小预测，利用WOLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）和 TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行亚细胞定位分析。拟南芥和水稻的TCP 基因序列分别下载自TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）和 PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）网站。

1.2 不同物种TCP家族系统进化分析

使用Clustal X 2.1 软件对芥菜、拟南芥和水稻的所有TCP 蛋白序列进行多序列联配[13]，将多序列联配的结果利用MEGA 6.06 软件采用邻接法（NJ）法进行系统进化分析[14]，校验参数bootstrap 重复1 000次，构建了系统进化树。

1.3 芥菜TCP家族基因的染色体定位分析

从芥菜基因组数据库（http：//brassicadb.org/）下载芥菜基因组信息，找出TCP 家族基因成员的染色体位置及结构信息，并利用MapInspect（http：//mapinspect.software.informer.com）软件绘制TCP 家族基因的染色体位置分布图。

1.4 芥菜TCP家族基因成员的序列结构和保守基序分析

登录 GSDS 服务器（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/），通过比对编码序列与基因序列信息，绘制TCP 家族基因的内含子和外显子的结构模式图。利用MEME（http：//meme-suite.org/）对芥菜 TCP 家族基因成员的保守基序进行分析，参数设定保守基序（motif）大小为10～100 个氨基酸，输出的结构域数目最大为15，motif 结构绘图采用 TBtools 软件[15]。

1.5 芥菜TCP家族基因在茎膨大不同时期的表达分析

茎瘤芥品种“涪杂2 号”不同发育阶段（茎的直径分别为2、4、6、8 cm）的转录组测序由本课题组完成，测序所获得的数据已提交至NCBI 网站，登录号为SRP151320。使用FPKM 值来反映TCP 基因在芥菜不同发育阶段的表达丰度，基因表达热图使用Microsoft Excel 2010 作图。

2 结果与分析

2.1 芥菜TCP家族成员鉴定

通过对芥菜全基因组数据库进行检索，并利用Pfam 工具鉴定结构域，最终获得53 条具有典型TCP结构域的序列，分别命名为BjuTCP1～BjuTCP53。根据序列信息进行理化性质分析，基因名称、登录号、氨基酸大小、分子量、理论等电点、染色体定位和亚细胞定位等特征见表1。结果显示，这些TCP 基因的氨基酸大小、分子量及等电点呈现出较大差异：氨基酸长度最短的是BjuTCP25 基因编码的蛋白，只含有216 个氨基酸，其蛋白分子质量为23 116.85 Da，氨基酸最长的是BjuTCP31 蛋白，含有437 个氨基酸，其蛋白分子质量为50 079.68 Da，理论等电点预测为5.50～10.18。根据亚细胞定位分析，绝大部分基因主要定位于细胞核，和已报道的其他物种中TCP 转录因子基因类似。

（续表1）

2.2 芥菜TCP家族系统进化树及聚类分析

为了分析TCP 转录因子家族基因的进化关系，选用模式植物拟南芥、水稻与芥菜一起构建系统进化树。在TCP 家族进化树中，53 个芥菜TCP、24 个拟南芥TCP 和21 个水稻TCP 呈现明显的聚类现象，如图1 所示，TCP 家族可清楚地划分为2 个大的亚家族，其中Class Ⅱ还可以细分为2 个小组，根据前人的分类方法，分别命名为：Class Ⅰ（PCF）、ClassⅡ（CIN）和 Class Ⅱ（CYC/TB1）。Class Ⅰ（PCF）包含的成员数目最多，其中芥菜Class Ⅰ（PCF）包含30个基因，水稻包含10 个，拟南芥包含13 个；其次是Class Ⅱ（CIN）亚组，包含 12 个芥菜基因、8 个水稻、8 个拟南芥；Class Ⅱ（CYC/TB1）成员数目最少，芥菜有11 个，水稻有3 个，拟南芥有3 个。

2.3 芥菜TCP家族基因结构及保守基序分析

TCP 家族成员的基因结构分析显示，44 个成员具有外显子结构，占全部基因的83%，仅有9 个基因含有1～3 个内含子，其中内含子序列较长的是BjuTCP32，达 600 bp 左右（图 2）。芥菜与番茄[16]、黄瓜[17]和柑橘[18]TCP 基因所含内含子数量所占比例类似，表明TCP 转录因子家族基因的结构和进化在物种间相对保守。

图1 芥菜、拟南芥和水稻TCP 基因系统进化树图Figure 1 Phylogenetic tree of all TCP genes in B.juncea，Arabidopsis and Oryza sativa

利用MEME 网站对芥菜TCP 家族进行基因序列的保守基序分析，所得结果见图2 和表2。分析结果发现芥菜所有基因都含有TCP 家族中最基本的motif 1，表2 横线处为motif 1 中氨基酸同源性大于90%区域，说明motif 1 是TCP 家族最重要的保守结构。TCP 家族不同组内保守基序的分布有较大差异，ClassⅠ组的大部分基因的保守基序数量明显比Class Ⅱ组的高。ClassⅠ组全部含有motif 1 和motif 2，且排列顺序都一样，说明这2 个motif 在ClassⅠ组内非常的保守；此外，一部分TCP 蛋白含有特有的基序，如 BjuTCP01 ～06 特异性含有 motif 9，BjuTCP07～20 特异性含有 motif 14，BjuTCP21～20 特异性含有motif 5 和motif 8，这些特异性的基序结构，可能与不同成员参与一些特定的调控过程有关。对于Class Ⅱ组来说，CYC/TB1 组中均含有motif 13，而 CIN 亚组不含有 motif 13 但含有 motif 6，且CIN 含有的基序模块明显少于CYC/TB1，说明两个亚组存在显著的模块差异，可能影响两个亚组成员的功能。整体看来，大部分位于同一亚族的基因具有相似的保守基序，并表现出一定的排列规律，与前面的系统进化树的分类相吻合，不同亚族成员间的差异也为研究TCP 家族中不同亚族的进化提供了参考。

2.4 芥菜TCP家族基因染色体定位分析

在所筛选出的53 个TCP基因中，除了BjuTCP46尚未确定染色体位置，其他基因都有明确的染色体信息（表1）。本研究利用MapInspect 软件绘制出剩余52 个TCP 基因家族成员在染色体上的分布情况，如图3 所示。结果发现仅A01 和A04 染色体没有基因分布，其余16 条染色体上基因分布位置不均匀，且B 类亚基因组中染色体分布的基因比A 类亚基因组多。A 类亚基因组染色体共含有24 个基因，占46%；B 类亚基因组含有基因28 个，占54%。一些TCP 基因在染色体上聚集在相近或相同的区域，表现出成簇的现象，例如A03 染色体上的BjuTCP45 和 BjuTCP22、A07 染色体上的下端 4 个基因、B07 染色体上的 BjuTCP31 和 BjuTCP32、BjuTCP30 和 BjuTCP43 等。

对染色体上基因数量的分布情况进行统计（图4），发现只有A03、B03 和B07 染色体分布有不同亚组的TCP 基因；A02 和B03 染色体上基因数目最多，达到6 个，但B03 分布种类更加丰富；A08、A10、B01 和B06 等4 条染色体只分布有 1 个基因，大都位于染色体下端。

2.5 芥菜TCP家族基因表达分析

图2 芥菜TCP 家族成员基因结构分析图Figure 2 Gene structure analysis of TCP family members in B.juncea

表2 芥菜TCP 蛋白基序信息Table 2 Motif information of TCP family proteins in B.juncea

图3 TCP 家族成员染色体定位信息Figure 3 Chromosomal localization of TCP family members

图4 芥菜各染色体TCP 基因分布数量Figure 4 Number of TCP genes in each chromosomes

根据芥菜瘤茎膨大不同时期的转录组数据，对TCP 家族基因的表达模式进行分析。通过比较不同发育阶段转录组数据中的表达丰度，除BjuTCP31、BjuTCP43、BjuTCP44、BjuTCP45 和 BjuTCP48 外，剩下的48 个基因都检测到了相应的表达量，基因的表达模式如图5 所示。芥菜TCP 基因的表达模式在不同亚组内具有较高的相似性，可以按亚组分成两类：ClassⅠ和ClassⅡ。ClassⅠ亚组基因整体呈现出较高的表达水平，推测Class Ⅰ亚组成员在茎发育中发挥重要的作用；其中ClassⅠ亚组中，BjuTCP02、BjuTCP03、BjuTCP04、BjuTCP05 和 BjuTCP06 在前 2个阶段表达量较高，后两个阶段明显下降，推测这几个基因参与了芥菜茎前期发育；ClassⅡ亚组成员整体表达量相对较低，除了BjuTCP39 外，其余基因表达量始终维持在较低的水平。在其他物种TCP 基因的功能研究中，发现Class Ⅰ亚组成员广泛参与了植物的生长发育，OsTCP7 基因在水稻分蘖期的表达量最高[19]，TCP15 与TCP22 之间可能存在功能冗余并共同调节叶片的衰老死亡过程[20]。芥菜中大量的TCP 家族基因在茎发育阶段的高表达，对茎瘤芥产品器官的正常发育起了重要的作用。

2.6 不同物种TCP基因数目比较

图5 芥菜TCP 基因在茎不同发育时期的表达模式热图Figure 5 Expression pattern of TCP genes in B.juncea at different stages of stem development

随着分子生物学和生物信息技术的发展，TCP家族基因相继在番茄、黄瓜、柑橘、葡萄以及砀山酥梨[16-22]等多种物种中得到鉴定。为了比较不同物种间TCP 家族成员的构成，我们检索了14 种植物的TCP 家族基因成员，各物种TCP 基因数量的统计情况见表3。结果显示，大部分物种Class Ⅱ含有的基因数量整体大于Class Ⅰ；除了苹果、番茄和葡萄外，PCF 亚组含有基因数量最多，CIN 亚组次之，CYC/TB1 亚组含量最少，但玉米中不含有CIN 亚组成员。虽然在不同物种中各个亚组基因数目存在差异，但几乎每个亚族所占比例较为一致，这些结果均揭示了TCP 家族在物种间的进化具有较高的保守性。双子叶植物明显比单子叶植物含有的TCP 基因数量更多，可能与基因组的进化关系有关，推测TCP 家族在双子叶植物的演化过程中发生了大规模的扩增；在双子叶植物中，TCP 基因数量从15～78之间不等，各科各属之间的TCP 家族基因数量存在着较大差异，蔷薇科的梨和苹果基因数量明显大于葫芦科的黄瓜和西瓜；与芥菜同属于芸薹属的其他植物含有TCP 家族成员基因数量也较大，以异源四倍体的甘蓝型油菜含有基因数量最多，几乎是白菜和甘蓝的2 倍，大致符合禹氏三角理论。

3 讨论与结论

TCP 转录因子是植物特有的一类转录因子家族，参与植物生长发育中的多种生理过程[7]。随着分子生物学技术的发展普及，TCP 转录因子家族基因相继在拟南芥、水稻、番茄、黄瓜、苹果及葡萄等物种得到鉴定。在拟南芥和水稻基因组中分别发现24和 21 个 TCP 基因[23]，黄瓜中鉴定 22 个[17]，葡萄中鉴定 15 个[21]，番茄中鉴定 36 个[24]，苹果中鉴定 52 个[25]。但芥菜TCP 家族基因成员还未见报道。本研究采用生物信息学的方法对芥菜全基因组数据库进行检索，共鉴定出53 个芥菜TCP 转录因子家族基因成员，并利用生物信息学方法对其进行较为系统全面的分析。与不同物种的TCP 基因数量进行对比（表3），各物种间有较大差异，甘蓝型油菜TCP 基因数量含量多，含78 个，芥菜次之。

表3 不同物种TCP 基因数目比较Table 3 The number of TCP genes in different species

根据序列基本特征分析显示，这些基因序列长度、氨基酸大小、分子量和等电点差异较大，且多编码碱性氨基酸，位于细胞核上；系统进化树分析把芥菜的53 个家族基因分为两大类：ClassⅠ（PCF）和Class Ⅱ（CIN），又称（CYC/TB1）；基因结构分析表明芥菜TCP 基因结构较为简单，大部分基因没有内含子，暗示了家族序列具有较高的保守性；保守基序分析结果与进化分析相匹配，各亚组内部保守基序有很强的特异含有性；染色体定位分析表明TCP 基因并不完全分配在芥菜的全部18 条染色体上，且呈现分布不均的现象，B 亚基因组含有的TCP 基因多于A 亚基因组，基因在染色体上呈现成簇或分散的现象，这可能与基因复制相关。

本研究进一步利用芥菜转录组数据，分析了TCP 基因在芥菜茎膨大时期的表达模式。基因表达分析结果也表现出聚类现象，基于进化分析，可将结果按表达量的相似性分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类。Class Ⅰ（PCF）大部分成员显示出较高的表达量，Class Ⅱ成员表达水平相对较低。这说明同一亚组的基因，功能上可能也存在较大的相似性。研究发现，TCP 转录因子家族在植物整个生长周期中参与多种生物学过程的调控，尤其与生长发育密切相关。Class Ⅰ（PCF）基因表达范围广泛，尤其在含有大量分生细胞的组织器官中特异性表达[5]。拟南芥AtTCP14 和AtTCP15 在幼穗茎、幼花花梗、子叶和叶原基节间表达，参与调节叶片叶形发育，通过促进细胞增殖来调节节间发育[26]。J.M.Davière 等[27]发现GA 激素参与TCP 基因对株高的调控过程，双突变体 AtTCP14 和 AtTCP15 会导致植物矮化；西瓜ClTCP14a 和ClTCP15 也有相似功能，通过与激素的相互作用参与植株的生长发育[28]。茎瘤芥的主要产品器官是其肉质瘤状茎，茎的膨大涉及大量细胞的增殖分化，有关基因参与茎膨大的转录调控研究目前还较少报道。芥菜Class Ⅰ（PCF）基因在茎发育时期显著表达，尤其是一些基因（如BjuTCP02、BjuTCP 03、BjuTCP04、BjuTCP05 和 BjuTCP06）显示出明显的阶段表达特点，推测该组成员在茎发育中起重要作用。Class Ⅱ由CYC/TB1 和 CIN 两个亚组组成，对该类成员的功能研究较多。金鱼草CYC 是第1 个被鉴定出调控不对称花发育的TCP 基因[3]；TB1 基因是侧枝发育的负调控元件，在拟南芥、玉米、水稻和矮牵牛中，该基因通过控制腋芽的生长来影响分蘖数，其缺失突变体均表现为腋芽增长侧枝增多[29-32]。CIN 亚组基因受到 miRNA319 调控，与叶片发育、叶片形态建成有关[33-36]。AtTCP2 和AtTCP17与植物光合作用有关，参与光信号传导途径[37-38]。在芥菜茎发育中，Class Ⅱ组成员表达量水平整体较低，可能未直接参与茎的膨大过程，但猜测可能在植物其他生长发育如叶的发育、花的发育中起作用。综合以上结果，我们发现芥菜的TCP 家族不同亚组成员对植物的调控存在一定的差异，各基因的具体功能还需要进一步的功能验证。本文基于全基因测序结果和转录组数据结果，对芥菜TCP 家族的成员进行了较为系统的鉴定和分析，为今后研究TCP 家族基因功能提供了理论依据，并为研究茎瘤芥生长发育奠定理论基础。