一种山桐子高质量DNA提取方法

徐阳，龚榜初*，吴开云，白杰健

(1.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省林木育种技术研究重点实验室，浙江 杭州 311400；3.青川县林业和园林局，四川 广元 628100)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim)，又称“油葡萄”[1]，适应性强、耐旱、耐贫瘠[2-5]，单株产果量高，全果含油，油脂品质高[6-7]，兼具多种保健功能[8]，是重要的木本油料物种，被誉为树上油仓[1]。同时山桐子树形优美，秋日果实深红色，圆锥状下垂，也是优良的园艺观赏树种[5,9-10]。山桐子产业目前在我国大有星火燎原之势，在全国各地正迅猛发展[10]。但山桐子童期长[11]、雌雄异株、雄株多的生物学特点[4]，不利于山桐子产业的快速发展，急需开展山桐子雌雄分化、油脂形成等方面的分子生物学研究，在此基础上，建立山桐子分子辅助育种体系，以加速山桐子产业发展。从生物体中提取DNA是进行分子生物学研究的基础，山桐子叶片和其他组织中富含大量的多糖、多酚、类菇烯等多种初生与次生代谢产物[12]，提取高质量的DNA比较困难[13]，属于一种顽拗植物[14]。受限于此，山桐子相关分子生物学研究进展缓慢，现有试剂盒等提取方法所提山桐子DNA浓度较低。李娜等[15]以山桐子转录组为材料，开发了19条简单重复序列(SSR)标记，为山桐子群体遗传学提供了较好的基础。在此基础上，初步展开的SSR等标记分型条带清晰度也有待提高。据此，本文在植物DNA常用提取方法CTAB法的基础上进行改良，以期提供一种山桐子高质量基因组DNA提取方法，为山桐子分子生物学研究提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年4月初，分别采集6份山桐子种质资源的嫩叶，每份种质视为1份生物学重复，然后装于冻存管立即存于液氮中，转移至-80 ℃冰箱保存。其中70、71、72号材料用于比较不同DNA提取方法的提取效果，70、71、72、73、74、75号共6份材料用于SSR分型与简化基因组测序。

1.2 方法

1.2.1 山桐子DNA提取

采用SDS法[16]、CTAB法[17]、试剂盒法(参照北京天根生化科技有限公司的植物基因组提取试剂盒)、改良CTAB法提取山桐子总DNA。

其中改良CTAB法具体方法：

首先，将嫩叶放入研钵中，加入液氮充分研磨，取粉末加入2 mL离心管中，加至1/2或2/5处为佳，加入PEG漂洗液，翻转混匀，离心收集沉淀，重复洗涤3次。PEG漂洗液[18-19]：5 mmol·L-1EDTA (pH=8.0)、50 mmol·L-1Tris-HCl (pH值8.0)、350 mmol·L-1山梨醇、10% PEG 8000、1% β-巯基乙醇(用前加入)。然后，向经PEG漂洗液漂洗的材料中加入1 mL裂解液，65 ℃裂解45 min后离心取上清。CTAB裂解液：1.4 mol·L-1NaCl (pH值8.0)，0.1 mol·L-1Tris-HCl (pH值8.0)，20 mmol·L-1Na·EDTA，2% CTAB，2%PVP。再加入同体积的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)混合液，翻转混匀，静置5 min，10 000g离心10 min，将上清转入新的2 mL离心管中；重复该步骤2～3次，直至分离相中间层无杂质(杂质较少)，上清液清澈。再次将上清液转入新的2 mL离心管中，加等体积的预冷异丙醇与0.1倍体积的3 mol·L-1醋酸钠(pH值5.2)，翻转，置于-20 ℃放置2 h，10 000g离心20 min，弃上清液，加1 mL 70%乙醇清洗DNA沉淀，转入1.5 mL离心管，10 000g离心5 min，倒掉上清，通风干燥约40 min，保证DNA充分干燥。最后加100 mL ddH2O溶解DNA，完全溶解后，进行检测或-20 ℃保存。

1.2.2 DNA检测与相关分子生物学试验

利用Nanodrop微量分光光度计检测各方法所提DNA的质量和浓度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测改良CTAB法的DNA完整度。

SSR引物选用李娜等[15]的8号SSR引物(F：TCTCCATCGTACTATTTGAATCTCAT，R：ATCAAT CAAATCAATCACAAGCC))。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5个循环；94 ℃ 1 min，Tm 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃ 8 min。利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶在垂直板电泳仪(美国Bio-Rad)进行SSR分型条带的电泳分离，250 V电压下电泳50～60 min，电泳后用AgNO3银染10 min，用生物电泳图像分析系统(美国Bio-Rad)进行观察、拍照。

利用内切酶组合RsaⅠ+HaeⅢ对山桐子基因组DNA进行酶切，酶切文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM 进行PE125 bp测序[20]。

2 结果与分析

2.1 各方法所提DNA浓度与质量

山桐子叶片中含有较多的杂质，提取DNA较为困难。利用SDS法进行山桐子叶片DNA提取，3个样本均能提取到一定量的DNA(32.1～80.6 ng·μL-1)，平均为57.73 ng·μL-1，浓度变异幅度较大，为42.21%(表1)；D260/D280为1.35～1.65，均小于1.8，所提DNA中含有较高蛋白质污染；D260/D230为1.01～1.20，均小于2，所提DNA中存在严重的糖类与盐污染。综合表明，利用SDS方法提取的3个样本DNA质量均较低，其中72号样本浓度仅为32.1 ng·μL-1，D260/D280为1.35，D260/D230为1.20，严重不合格，无法用于后续的分子生物学研究。

表1 不同DNA提取方法所得山桐子DNA质量比较

利用试剂盒法提取的山桐子DNA，相对于SDS法，纯度有较大提升，D260/D280为1.77～1.81，所提DNA中少量蛋白质污染，D260/D230为1.46～1.79，糖类与盐污染得到一定的控制。CTAB法提取的山桐子DNA浓度显著高于试剂盒法和SDS法，平均浓度达144.33 ng·μL-1，其中70号样本DNA浓度可达223.2 ng·μL-1。但CTAB法所提DNA样本间浓度变异幅度较大，达49.84%，不利于后续分子生物学对样本浓度的标准化要求；D260/D280比值与试剂盒法相当，为1.62～1.83，DNA样本中可能存在蛋白质与酚类物质污染，D260/D230低于试剂盒法，高于SDS法，表明所提DNA中也存在较高的糖类与盐污染。

利用改良的CTAB法提取的3个山桐子样本DNA浓度可高达417.5～470.5 ng·μL-1，平均为438.93 ng·μL-1，为试剂盒法的8.5倍。D260/D280为1.94～1.97，均高于1.8，D260/D230为2.10～2.17，均高于2，表明各样本DNA浓度高、纯度高，蛋白质、糖类与盐污染得到极好的控制。电泳结果(图1)显示，改良CTAB法提取的DNA条带稍有拖尾，整齐明亮，说明DNA得率较高且完整。同时样本浓度与纯度各指标变异幅度最少，能够满足分子生物学对样本标准化的要求。

M，DNA maker；70、71、72分别为70、71、72号样本DNA。图1 改良CTAB法所提山桐子DNA电泳图谱

2.2 利用改良CTAB法提山桐子DNA的SSR标记结果

SSR标记具有共显性、高度重复性等优点，在分子群体遗传进化、辅助育种等方面应用广泛。本文利用改良的CTAB法提取6个山桐子样本DNA，采用李娜等[15]的8号引物进行SSR标记分型。图2显示，6个样本的SSR标记条带均比较清晰，表明改良的CTAB法所提取的DNA可以满足SSR标记相关分子试验所需。

M，DNA maker；左侧为maker各条带大小；70～75分别为70、71、72、73、74、75号山桐子样本。图2 利用改良CTAB法所提6个山桐子样本的SSR标记聚丙烯凝胶电泳结果

扩增片段长度多态性(AFLP)技术、简化基因组测序等技术可提供较高通量的标记数，在群体分析中具有较高的效率，但此类研究往往依赖于酶切效果，而基因组DNA样品纯度较低等因素可能影响限制性内切酶的活性，导致部分酶切位点未被酶切开，因此对DNA要求较高。酶切效率是评价简化基因组实验是否成功的一个关键指标。本文采用RsaⅠ+HaeⅢ组合对改良CTAB法所提的山桐子DNA进行酶切，进行酶切文库的质量评估，并利用IlluminaHiSeqTM 进行PE125 bp测序。本试验的酶切效率为90.32%，表明酶切效率正常。同时，测序reads插入片段长度主要为364～444 bp(图3)，表明所提DNA可以满足基因组测序等试验要求。

图3 Reads插入片段分布

3 小结与讨论

常用的提取植物核酸的方法如SDS法、CTAB法等只适用于部分植物，用于山桐子DNA提取存在较大局限性。SDS法操作简单、温和，如本文数据显示，通过该方法可提取到一定量的山桐子DNA，但所得到的产物质量与纯度不高，糖类、蛋白质、盐类杂质较多。通过CTAB法，可提取纯度较高的山桐子DNA，且对蛋白质污染有较好的控制，DNA纯度有所提高。但酚类污染仍较严重，且山桐子样本DNA浓度与纯度变异幅度较大，试验中多次抽提试验周期较长。随着提取技术的发展，基于高效核酸吸附柱的核酸提取试剂盒出现，大大提高了核酸提取效率[15]。但本文数据显示，尽管试剂盒法提取的山桐子DNA纯度得以提升，但提升幅度较小，各山桐子样本DNA浓度仍较低。

Kobayashi等[19]研究发现，PEG洗脱液可有效洗脱植物代谢产物，在鹅掌楸高质量DNA提取中应用效果较好。在此基础上，本文以CTAB法为基础，裂解前进行PEG洗脱，并优化与简化后续CTAB法操作步骤，形成适宜山桐子高质量DNA提取的改良CTAB法。通过本文方法提取的山桐子DNA，DNA浓度可高达417.5～470.5 ng·μL-1，平均为438.93 ng·μL-1，为试剂盒法的8.5倍，所提各样本DNA蛋白质、糖类与盐污染得到极好的控制，DNA得率较高且完整，同时各样本浓度与纯度各指标变异幅度最少，可以满足分子生物学对样本DNA质量标准化的要求。采用本文改良CTAB法提取的山桐子DNA，可以满足SSR标记分型、简化基因组测序等相关分子试验所需，为山桐子分子生物学的开展提供了基础。