SP600125阻断JNK信号通路下电针对慢性不可预知性温和应激大鼠HPA轴的影响*

李亚欢，梁星辰，姜会梨，赵冰骢，孙 阳，高兴州，李 想，冯世醒，李宇飞，图 娅

(北京中医药大学，北京 100029)

抑郁症是临床常见精神障碍类疾病，临床症状涉及广泛，其症状的主要特征是情绪障碍、快感缺乏、认知功能障碍或复发易感性增加[1]。研究表明，抑郁症发病与应激密切相关[2]。应激可以激活JNK信号通路，引起下丘脑-垂体-肾上腺素轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)功能亢进，损伤海马组织[3]，导致抑郁样行为。由于抑郁症发病机制不明确，传统抗抑郁药物治疗手段有限，且存在无应答、副作用大的特点，因此迫切需要新的治疗手段。研究显示，针灸治疗抑郁症疗效肯定[4-6]，但针刺是否通过JNK信号通路调节HPA轴发挥抗抑郁作用还需要进一步的研究。本实验将观察当JNK信号通路被其特异性阻断剂SP600125阻断后，电针对慢性不可预知性温和应激(CUMS)模型大鼠行为学的影响和对HPA轴相关指标的调节作用，探究电针及氟西汀治疗CUMS大鼠的异同，进一步探讨电针抗抑郁机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，7周龄，160～200 g[北京维通利华，SCXK(京)2012-0001]。实验动物自购入后，饲养于北京中医药大学的清洁级动物房，适应性喂养1周，群养，自由摄食饮水，昼夜交替光照，温度18～25℃，湿度(55±2)%。本实验过程中的所有操作均在以减少、替代和优化为核心的“3R”原则的指导下进行，善待实验动物，维护动物福利。

1.2 主要仪器与试剂

无菌针灸针(规格：0.20 mm×25 mm，苏州环球牌);脑立体定位仪(美国Stoelting);电针仪(北京华卫，型号：HANSLH-202)；盐酸氟西汀(美国礼来);SP600125阻断剂(美国Selleck);二甲基亚砜(DMSO);大鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)ELISA检测试剂盒、大鼠促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)ELISA试剂盒、大鼠皮质酮(CORT)ELISA试剂盒(20160219，BG)。

1.3 分组及干预方法

72只SD大鼠随机分为8组:空白组、模型组、氟西汀组、电针组、溶剂组、阻断剂组、氟西汀+阻断剂组、电针+阻断剂组。除空白组大鼠群养、自由摄食饮水外，其余组均1只/笼孤养，且每日随机给予1种刺激方法。氟西汀组和氟西汀+阻断剂组，于每日应激前30 min氟西汀灌胃。电针组和电针+阻断剂组，每日应激前30 min电针干预。溶剂组，于应激前1 h给予与阻断剂溶液同等剂量的DMSO侧脑室注射，剂量10 μL/d。阻断剂组、氟西汀+阻断剂组和电针+阻断剂组，于应激前1 h给予DMSO配制的阻断剂溶液进行侧脑室注射，剂量10 μL/d。

针刺方法:根据本团队前期研究，参照《实验动物针灸穴位图谱》，选取相当于人体解剖部位的“内关”和“三阴交”两穴，内关穴直刺，深度3～5 mm,三阴交穴直刺3～5 mm，接电针2 Hz、0.6 mA，以局部微颤为宜，20 min/次，1次/日，持续21天。

阳性药物给药方法:0.2 mg/mL的氟西汀混悬液，灌胃给药，1.8 mg/kg，1次/日，持续21天。

1.4 模型制备

本实验的造模方法为常用的CUMS法[1,7]，操作方法：使用7种不可预知的温和性刺激(包括：夹尾3 min、震荡30 min、束缚2 h、夜间光照12 h、断食24 h、断水24 h和潮湿垫料24 h)持续刺激21天，平均每种刺激使用3次，每日的刺激不应在同一时间段进行，避免大鼠产生耐受性，影响实验结果。实验开始前1周，溶剂组、阻断剂组、氟西汀+阻断剂组、电针+阻断剂组大鼠均行侧脑室套管埋置术。实验过程中注意保持室内整洁、安静，温度、湿度适宜，尽量减少空气流动，实验人员操作力度适当，避免影响实验结果。

1.5 侧脑室套管埋置及给药方法

根据文献所示操作方法[1]，采取腹腔注射法，注射10%的水合氯醛麻醉大鼠。待大鼠倒下，全身无力，反应消失后，将其放置于脑立体定位仪上，固定，保持大鼠颅骨水平位置，寻找前囟点。用定位仪确定大鼠侧脑室的具体位置(旁开约1.5 mm，前囟后0.9 mm)，迅速标记，钻孔，植入套管，固定周围组织。注射套管保持被套管帽覆盖状态，仅在注射药物时开启。术后恢复7天。

根据计算，将适量的SP600125倒入DMSO溶液中，配制成浓度10 mg/mL的SP600125阻断剂溶液，实验第1天开始，每两日注射1次，左右交替进行，剂量10 μL/d，持续21天。DSMO溶液，实验第1天开始每两日注射1次，左右交替进行，剂量10 μL/d，持续21天。

1.6 糖水实验

本研究采用糖水实验反映大鼠快感缺乏的抑郁样行为。于实验前2天，对大鼠进行1%糖水适应性训练，随后禁食12 h。在实验开始前1天，实验第7天、14天和21天的同一时间段，以同样方法测量大鼠1 h的糖水消耗量，共4次，计算糖水偏好指数，对比大鼠糖水偏好指数变化。计算方法：糖水偏好指数(100%)=糖水摄入量/总液体摄入量×100%。

1.7 ELISA法检测大鼠下丘脑CRH和垂体ACTH含量

实验结束后，用抽签法从每组随机选取6只大鼠，麻醉，冰上快速分离垂体与下丘脑，置于液氮中，转移到冰箱保存(温度：-80℃)，等待检测。应用酶联免疫吸附剂测定技术(ELISA法,反相竞争法)检测大鼠下丘脑CRH和垂体ACTH含量。检测方法按照ELISA试剂盒操作方法进行检测。

1.8 ELISA法检测大鼠血清ACTH和CORT含量

实验完成后，随机从每组中抽取6只大鼠，麻醉，腹主动脉取血，血样置于10 mL离心管，静置1 h(室温)，离心20 min(r=3 000 r/min)，取上清液，分装于1.5EP管中，于低温冰箱中冷冻保存，温度：-80℃。用ELISA法检测大鼠血清ACTH和CORT含量。具体检测方法参照ELISA试剂盒操作方法进行检测。

1.9 统计方法

2 结果

2.1 糖水偏好指数结果

相对于模型组而言，氟西汀+阻断剂组的大鼠糖水偏好百分数显著降低(P<0.01)；与氟西汀组相比，电针组大鼠明显升高(P<0.05)；与溶剂组相比，电针组大鼠糖水摄入量升高(P<0.01)。见表1和封三彩图1。

表1 各组大鼠糖水偏好指数

注：组间差异(F=2.904，P=0.011)；组内差异：测量时间(F=7.043，P=0.000)；组别×测量时间(F=0.514，P=0.962);与模型组相比，##P<0.01；与溶剂组相比，▲▲P<0.01；与氟西汀组相比，■P<0.05。

2.2 各组大鼠垂体ACTH和下丘脑CRH含量变化

与空白组相比，模型组垂体促肾上腺皮质激素表达显著增加(P<0.01)；相对于模型组而言，氟西汀组大鼠的垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)含量显著降低(P<0.01)，电针组大鼠的垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)含量显著降低(P<0.01)；与溶剂组相比，阻断剂组明显降低(P<0.05)，氟西汀+阻断剂组显著降低(P<0.05)，电针+阻断剂组大鼠垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)水平显著降低(P<0.01)；与阻断剂组相比，电针+阻断剂组的垂体促肾上腺皮质激素含量显著降低(P<0.05)；与氟西汀+阻断剂组相比，电针+阻断剂组垂体促肾上腺皮质激素含量显著降低(P<0.05)。各组大鼠下丘脑CRH表达干预前后无显著差异(P>0.05)。见表2和图2。

表2 各组大鼠垂体ACTH和下丘脑CRH含量变化

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与溶剂组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与阻断剂组比较，■P<0.05；与氟西汀组比较，◆P<0.05；与氟西汀+阻断剂组比较，◇P<0.05。

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与溶剂组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与阻断剂组比较，■P<0.05；与氟西汀组比较，◆P<0.05；与氟西汀+阻断剂组比较，◇P<0.05。图2 各组大鼠垂体ACTH和下丘脑CRH含量变化

2.3 各组大鼠血清ACTH和CORT含量变化

与空白组相比，模型组血清ACTH表达显著增加(P<0.05)；相比于模型组，氟西汀组大鼠血清促肾上腺皮质激素(ACTH)显著降低(P<0.01)，电针组血清促肾上腺皮质激素显著降低(P<0.05)；与溶剂组相比，电针+阻断剂组血清的促肾上腺皮质激素水平降低(P<0.05)；相比于阻断剂组，电针+阻断剂组血清的促肾上腺皮质激素含量降低(P<0.05)。

与空白组相比，模型组血清CORT表达显著增加(P<0.01)；与模型组比较，氟西汀组血清CORT降低(P<0.01),电针组血清的CORT含量也有降低(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠血清ACTH和CORT含量变化

注：血清ACTH组间差异(F=3.528，P=0.005);血清CORT组间差异(F=2.335,P=0.043)。与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与溶剂组比较，▲P<0.05；与阻断剂组比较，■P<0.05;血清CORT组间差异(F=2.335，P=0.043)。

3 讨论

抑郁症是一种情绪低落、兴趣丧失以及精力缺乏为主症的临床常见精神疾患，是全球疾病负担的重要贡献者，在医学研究领域备受关注[8]。2019年2月18日，北京大学第六医院黄悦勤教授等在《柳叶刀·精神病学》发表研究文章，报告了中国精神卫生调查(CMHS)的患病率数据：样本来自中国除港澳台地区的31个省、自治区及直辖市，157个国家CDC疾病监测点(县/区)，共32 552人完成了调查。研究发现，排除痴呆后，六大类精神障碍(心境障碍、焦虑障碍、酒精/药物使用障碍、精神分裂症及相关精神病性障碍、进食障碍、冲动控制障碍)的加权12月患病率为9.3%(95% CI 5.4-13.3)，加权终生患病率为16.6%(13.0-20.2)。抑郁症发病复杂，与社会环境、生化、遗传等因素密切相关。研究发现，抑郁症发病与区域脑容量变化(尤其是海马区)及功能性大脑环路(如认知控制网络)改变关系密切。抑郁症的病理机制过程中有确切的神经生物学应答系统功能紊乱，包括 HPA轴功能紊乱和免疫系统紊乱。

应激是在内稳态受到威胁时，机体为了保持内稳态的平衡而产生的一系列适应性反应。一定程度的应激能激活机体非特异适应系统，提高抵抗力，但是严重或持久的应激则对身体无益，尤其是慢性应激。慢性应激严重影响着人类的身心健康，容易诱发躯体或精神疾病[9]，导致抑症的发生，诱发抑郁样行为。糖水实验可以基于奖赏系统评价抑郁症模型快感缺乏程度。本实验采用糖水偏好指数作为行为学观察指标，观察大鼠快感缺失的抑郁样行为。研究结果显示，慢性不可预知应激诱导模型组大鼠糖水偏好指数显著降低，是大鼠对糖水奖赏的敏感性降低的结果，是快感缺乏程度加重的表现，这与先前研究具有一致性[10]。针刺干预有效逆转了大鼠糖水偏好指数降低,明显改善了大鼠抑郁样行为。本实验中各组大鼠糖水偏好实验的基线行为学数据存在组间差异，这可能是由于经侧脑室套管埋置术组别经过手术刺激的干扰所致。其潜在原因和机制，本团队正在进行深入研究。

HPA轴功能亢进，是抑郁症的重要发病机制之一[11-12]。随着刺激的持续，下丘脑释放大量CRH，刺激垂体合成、释放大量的促肾上腺皮质激素，外周血促肾上腺皮质激素水平增加，作用于肾上腺皮质，导致肾上腺皮质和外周血的皮质醇(CORT)含量均上升。针刺可调节HPA轴功能状态，缓解亢进状态，下调ACTH、CORT水平，纠正HPA轴紊乱，从而起到抗抑郁的作用。本团队前期研究发现，电针在下调慢性应激抑郁模型大鼠HPA轴上关键性指标ACTH及CORT的表达及减轻抑郁症状上有稳固效果[13-14]。电针结合氟西汀干预慢性应激模型大鼠的研究表明，电针治疗在逆转HPA轴高功能状态方面，有着与氟西汀相当的疗效[15]，但是，电针结合氟西汀的治疗却比两者单用效果显著，提示电针有与氟西汀相当水平的抗抑郁作用，并与氟西汀具有协同抗抑郁作用。

c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)即为应激活化蛋白激酶(SAPK)，能激活Ser63和Ser73两个c-jun氨基末端区域，是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的主要成分，参与细胞分化、细胞凋亡和机体应激反应过程，从而广泛牵涉多种疾病的发生演变，且发挥重要作用[16-19]。MAPK家族是重要的细胞内信号传导系统，负责各种外部刺激信号从细胞表面传导到细胞核内部，参与调节多种重要的生理过程。JNK的激活常见于各种神经退化性疾病当中，近年的研究成果已逐渐证实JNK的激活在抑郁行为调控中的重要作用。JNK信号通路的信号转导是级联反应。MKK4和MKK7可以磷酸化JNK信号通路上的两个位点而激活JNK信号通路，引发活化的JNK中的一部分从核外向核内的转移，继而激活新蛋白质的合成途径，发挥效应。JNK/MAPK可以通过加速c-jun磷酸化和激活Caspase家族的凋亡蛋白两种途径启动细胞凋亡程序[20-21]。

本实验显示，本实验中采用的应激方法成功激活了大鼠海马的JNK信号通路，影响了HPA轴上关键性指标含量，导致ACTH、CORT和CRH含量水平升高，致使出现抑郁样行为，与前期研究结果一致[22-29]。JNK信号通路特异性阻断剂SP600125能特异性地阻断JNK信号通路，且具有高度特异性，能明显降低JNK信号通路的活性，且其作用强度比MAPK激酶ERK1、p38-2和丝/苏氨酸激酶PKA更高。研究显示，阻断剂SP600125与电针共用和与氟西汀共用时，均能产生较单用电针和氟西汀更好的疗效，SP600125能够减少c-jun的磷酸化[30]。本实验研究发现，电针可调控JNK信号通路的活性，下调ACTH、CORT和CRH水平，从而改善抑郁样行为，且与阻断剂同用具有协同作用，治疗效果更显著。与前期研究具有一致性。

根据本团队前期研究，本研究选取了“内关”和“三阴交”两穴。内关，为手厥阴心包经之络穴，能安神定悸，“心澹澹而善惊恐心悲，内关主之”；同时，内关通阴维脉，为“八脉交会穴”之一，精神疾病的发生多与阴维脉功能失调有关，“阴阳不能自相维，则怅然失志”。三阴交为足三阴经之交会穴，能健脾、疏肝、益肾、调和气血，两穴共用能疏肝解郁、镇静安神。董佩等[31]分析研究针刺治疗原发性抑郁症的选穴规律，发现：内关、三阴交是临床针刺治疗抑郁症中使用频率仅次于百会、印堂的穴位。马学红等[32]在针刺联合西药治疗抑郁症的临床研究中发现，针刺内关、三阴交等穴，可以明显降低轻中度抑郁症患者的汉密尔顿量表(HAMD-17)和基于患者报告的症状量表(MYMOP)得分，缓解抑郁状态，改善患者总体健康状况和活动情况，且治疗效果优于单纯的西药治疗。

总之，针刺治疗对于缓解抑郁症患者的躯体障碍、情感障碍和认知障碍的疗效已经被证实，且治疗优势显而易见，不会产生抗抑郁药常见的副作用[33-35]。可见，进一步深入探讨抑郁症发病机制及针刺抗抑郁机理的必要性。本研究结果具有启发性，电针对慢性不可预知性应激抑郁状态的治疗作用可能是通过干预JNK信号通路发挥调节HPA轴功能来实现的。因此，通过探究其在细胞和分子水平可能的发病机制将为寻找更有效的抗抑郁防治方法的重要途径，可能对于揭秘针刺抗抑郁机制意义非凡，因此本研究团队正在进一步深入研究中。