枸杞总黄酮提取工艺优化及不同年份枸杞总黄酮含量测定

刘元林，龙 鸣，田晓静，张福梅，陈士恩，马忠仁，，NuruI Izza Nordin

(1．西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124；2.西北民族大学 生物医学研究中心中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030；3.Industrial Biotechnology Research Centre，SIRIM Berhad，1 Persiaran Dato' Menteri，Section2，40700 Shah Alam，Selangor，Malaysia)

全球约有80多种枸杞属植物[1]，而我国枸杞主要分布于宁夏、甘肃、青海、新疆、山西、河北、陕西和内蒙古等地区，其中宁夏枸杞2009年被列入《2010版中华人民共和国药典》，是惟一被列为可以用作药品的枸杞品种[2].枸杞含有丰富的类胡萝卜素、多糖及黄酮类等一些生理活性物质，具有免疫调节、造血功能作用[3].黄酮是枸杞的主要有效组分之一，有较为广泛的生理活性作用且有药用保健功能[4-5].随着黄酮类化合物研究开发，枸杞中黄酮类化合物的研究逐步得到关注.目前枸杞总黄酮提取方法主要有有机溶剂提取法、超声波辅助酶提取法、微波辅助酶法、微波法、酶解法等.检测方法有分光光度法、色谱法、极谱法、薄层色谱法等[6-7].对枸杞总黄酮的研究有一定成果，如枸杞总黄酮不同提取方法比较[8-9]、枸杞总黄酮提取工艺的优化[10-12]、枸杞不同部分黄酮研究[13]、枸杞黄酮的分离纯化[14-15].在贮藏过程中，枸杞内部成分会随存储时间延长而改变[16]，以致枸杞的药用效果降低.当今市场上销售的枸杞质量鱼龙混杂，导致市售枸杞质量参差不齐，使消费者的正当合法利益受到侵害.

现有研究主要针对枸杞总黄酮提取方法的优化，而在储存时间对枸杞总黄酮影响方面的研究较少.本文以乙醇提取法进行提取，采用单因素实验研究浸提温度、乙醇体积分数、料液比和提取时间四个因素对总黄酮提取的影响规律，再采用四因素三水平正交试验乙醇提取工艺.在此基础上，研究枸杞总黄酮含量随储存年份变化情况及结合物理指标进行主成分分析，为快速鉴别枸杞的优劣、有效监测枸杞总黄酮类化合物含量的变化规律及保护消费者健康提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验优化样品购于淘宝、不同生产年份枸杞样品(2016、2015、2014年及4年以上老陈果)均购自宁夏中宁枸杞市场.对样品购回后，置于-4 ℃冷冻待用.样品具体信息见表1.

DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；722E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；AB-S型电子分析天平(梅特勒—托利多公司)；SXT-06型索氏提取器(上海宏纪仪器设备有限公司)；DG120型中药材粉碎机(浙江瑞安市春海药材器械厂)；色差计(青岛帝中计量仪器有限公司).

无水乙醇、石油醚、乙醚、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯，产自烟台市双双化工有限公司；芦丁标品，分析纯，SR8250，购自北京索莱宝科技有限公司.

表1 样品信息表

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

剔除枸杞中不完整粒与杂质后，置于55 ℃烘箱干燥至恒重.干燥完成后取出并于中草药粉碎机中粉碎，迅速以密封袋密封，置于-4 ℃冷藏待用.

1.2.2 单因素实验

乙醇提取法受到浸提温度、乙醇体积分数、料液比、提取时间等因素的影响.本研究以枸杞总黄酮提取率为指标，通过单因素实验研究浸提温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)，乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)，料液比( 1∶5 g/mL、1∶10 g/mL、1∶15 g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL)，提取时间(1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h)对提取率的影响规律.

1.2.3 正交实验

在单因素实验基础上，采用四因素三水平正交试验优化提取工艺，进行L9(34)正交试验设计.正交实验因素水平设计见表2.

1.2.4 枸杞黄酮提取率的测定

参照刘景煜[17]等人所用方法，采用分光光度计法测定枸杞总黄酮含量，以芦丁标准样含量(C)mg/mL为横坐标，吸光值(A)为纵坐标，用最小二乘法求得回归方程，得到方程为：C=3.9435A+0.008；相关系数为R2=0.9940，在0.01～0.110 mg/mL区间有较好的线性相关性.

准确称取约1.0 g干燥的枸杞粉末，用适量乙醚和石油醚混合物进行脱脂4 h，脱脂后进行总黄酮提取，用相同体积分数有机溶剂溶液反复冲洗.使用有机溶剂溶液定容到100 mL，作为样品液备用.用移液管精确移取样品液5.0 mL置于带刻度的具塞比色管中，测定波长为510 nm处样液吸光值.根据标准曲线计算出被测液中总黄酮的浓度，代入公式计算总黄酮的提取率，公式如下：

(1)

式中：C为标准方程计算的样品比色液中的芦丁浓度(mg/mL)；

V为比色试液体积(mL)；

d为稀释倍数；

m为样品的质量(g).

表2 正交试验因素水平表

1.2.5 物理参数检测

参照GB/T18672[18]和SN/T 0878[19]标准，采用称量方法测定百粒重；结合称量与计数测量粒度；使用游标卡尺测量枸杞子的长轴长和短轴长;采用色差计测量a*、b*、L*.每个参数重复检测三次，取其平均值进行后续分析.

1.3 数据处理

采用主成分分析(Principle component analysis，PCA)对不同生产年份进行定性判别.实验数据采用SAS 8.0软件(美国SAS软件公司)进行数据分析.实验结果图由Origin 8.0软件(美国OriginLab公司)绘制.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浸提温度与总黄酮提取率的关系

在乙醇体积分数80%、料液比1∶15 g/mL、提取时间2.5 h、提取2 次的条件下，研究浸提温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80℃、90 ℃)对枸杞总黄酮提取率的影响.结果见图1(A)，随浸提温度升高提取效果显著增加.当达到80 ℃时温度继续提升，提取效果开始下降，70 ℃与80 ℃的提取率相差特别小，故70 ℃、80 ℃为较佳浸提温度.

2.1.2 乙醇体积分数与总黄酮提取率的关系

在浸提温度为70 ℃，料液比为1∶15 g/mL、提取时间为2.5 h、提取2 次的条件下，研究乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)对枸杞总黄酮提取率的影响.结果见图1(B)，枸杞总黄酮提取率随着乙醇体积分数升高而上升.当乙醇体积分数超过80%，提取率随乙醇体积分数的升高而降低，因此，乙醇提取枸杞黄酮的较佳浓度为80%.

2.1.3 料液比与总黄酮提取率的关系

在浸提温度为70 ℃、乙醇体积分数为80%、提取时间2.5 h，提取2 次的条件下，研究料液比( 1∶5 g/mL、1∶10 g/mL、1∶15 g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL)对枸杞总黄酮提取率的影响.结果见图1(C).就料液比而言，在1∶5～1∶15 g/mL随乙醇有机溶剂使用量的增加，提取率也随着增加，但超过1∶15 g/mL后效果下降.因此，提取枸杞黄酮较佳料液比为1∶20 g/mL.

2.1.4 提取时间与总黄酮提取率的关系

在浸提温度为70 ℃、乙醇体积分数为80%、料液比为1∶15 g/mL、提取2 次的条件下，研究提取时间(1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h)对枸杞总黄酮提取率的影响.就提取时间而言，在1 h～2.5 h 内，总黄酮提取效果和时间成正相关关系，时间增加黄酮提取率也随之增加.在2.5 h时达到峰值.此后即使时间增长，提取率也还在下降，故较佳提取时间为2.5 h.

图1 单因素对枸杞总黄酮提取率的影响(A：浸提温度;B：乙醇体积分数;C：料液比;D：提取时间)

2.2 正交试验结果

以浸提温度、乙醇体积分数、料液比、提取时间为因素，以总黄酮提取率为指标，采用四因素三水平正交实验优化，其设计表及结果见表3.

表3 正交试验结果表

正交试验结果见表2.极差分析的结果表明，影响顺序依次为A>D>C>B，即浸提温度对黄酮提取效率产生主要作用，其次是提取时间、料液比及乙醇体积分数.较佳提取参数为A2B2C2D2，即浸提温度70 ℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶15 g/mL、提取时间为2.5 h.结果与孔令明[12]和韩荣生[13]等人得出的结论相近.验证发现，在该条件下提取率平均值为1.95%±0.013，浸提提取最佳工艺稳定有效.

2.3 不同年份枸杞总黄酮提取率及物理指标含量测定

在上述正交试验最佳工艺(浸提温度70 ℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶15 g/mL、提取时间2.5 h)条件下，提取五个不同年份宁夏枸杞总黄酮(P<0.05)，结果见图2.由图2可知，2016年的两种样品间不存在显著性差异；2016年的所有样品和其他年份的样品有显著性差异.2015年宁夏样品和其他年份的样品有显著性差异.2014年样品和其他年份样品有显著性差异；4年以上老陈果和其他样品间存在显著性差异.这与杨丽[16]等人和王晓宇[20]得出的结论一致.随存储时间加长、枸杞内部的芦丁含量下降，并可根据其内部黄酮提取率来判断枸杞的新鲜程度.

图2 不同年份枸杞总黄酮提取率

2.4 多元统计分析

以色度、长轴长、短轴长、粒度、百粒重、年份和黄酮提取率等参数为输入，采用SPSS 20.0统计分析软件进行主成分分析，以前两个主成分得分绘图，实现多指标综合分析，并将多维信息降低至两维，直观反映不同贮藏年份枸杞的差异，PCA结果见图3.

图3 不同年份宁夏枸杞品质主成分分析结果

如图3所示，以理化指标作为变量时，第1主成分占全部的54.09%，第2主成分占全部的18.55%，总贡献率达到72.64 %，代表了原始数据大部分信息，不同组样品彼此区分，且组内聚集，能实现五个年份枸杞的区分.2015NG样品因原料为宁夏2015年枸杞果，样品数据点位于图中右上角，与其他组样品有明显区分.颜色较高的4NYG和2014NG样品分布在图中左半部分，且色泽沿着PC2增大方向而加深.此部分为存储时间较长的样品.颜色较浅的三组样品(2016NG-1、2016NG-2和2015NG)位于图中右半部分，此部分样品的存储时间较短.

3 结论

单因素实验和四因素三水平正交实验优化乙醇提取枸杞总黄酮工艺，确定较佳的提取条件为A2B2C2D2，即浸提温度70 ℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶15 g/mL、提取时间为2.5 h、提取2次.在此优化条件下，确定不同生产年份枸杞黄酮含量差异，发现不同年份的枸杞黄酮含量差异显著，存储时间越短，其内部黄酮损耗越小.通过主成分分析，能将五个年份枸杞子区分开，这为枸杞新陈的定量判定提供理论依据，对枸杞的开发利用和相关监督部门执法提供科学依据.