菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用

宫 强，郭洁真，杜珍奇，阮梦蝶，牛明福，秦翠丽

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471023)

铜绿假单胞菌广泛存在于水、土壤、尘埃、植物、动物和人体的会阴、腋窝、耳蜗等处，属于人畜共患的条件性致病菌，感染人后可引起肺炎、泌尿系感染、脑膜炎等疾病，尤其是该菌导致的肺部感染，患者病死率较高，成为临床肺部感染的一大难题。此外，水貂、禽类等多种动物也会感染该菌，给养殖业带来一定的损失。目前对于该菌的治疗仍然主要依赖于抗生素，但近年来关于铜绿假单胞菌耐药性的报道屡见不鲜，且呈现广谱耐药性，给临床治疗带来了极大的挑战[1]。

对于细菌类疾病的控制，除应用抗菌药物外，疫苗免疫不失为有效的手段之一。对铜绿假单胞菌疫苗的研究报道虽然不在少数，然而目前在人医和兽医临床上均无可用的商品化疫苗，因此，研制针对该菌的新型有效疫苗迫在眉睫。DNA 疫苗因具有制备方便、成本较低等优点而广受关注，但细菌DNA 疫苗的免疫效果普遍不及传统的灭活疫苗和弱毒疫苗，如何提高DNA 疫苗的保护效果已经成为该领域的研究重点之一，常用的策略包括优化接种方式、使用新型疫苗佐剂等。

本实验构建了铜绿假单胞菌鞭毛蛋白flgE基因的DNA 疫苗，以天然多糖菊粉为佐剂，免疫小鼠检测了其诱导的体液和细胞免疫应答水平及攻毒保护效果，旨在为铜绿假单胞菌病DNA 疫苗及DNA疫苗新型佐剂的研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 动物与菌种 6 周龄～8 周龄BALB/c 小鼠购自河南科技大学医学技术与工程学院；铜绿假单胞菌、大肠杆菌DH5α 感受态细胞为本实验室保存。

1.2 主要试剂 菊粉为Sigma 公司产品(批号225596T)；羊抗小鼠IgG-HRP 购自诺唯赞生物科技公司；BamHⅠ和EcoRⅠ购自赛默飞世尔科技公司产品；MTT 购自北京鼎国昌盛生物公司；小鼠IFN-γ ELISA 试剂盒购自嘉美生物技术公司；真核表达载体pcDNA3.1(+)为本实验室保存。

1.3 重组质粒的构建 根据GeneBank 中铜绿假单胞菌的flgE基因设计合成用于扩增该基因的引物(PU：5'-ACTGGATCCATGAGTTTCAACATCGGCCT GAGCG-3'/PL： 5'-GCGAATTCTCAGCGCAGGTTGA TGATGGTCTGG-3')，上下游引物序列分别含有BamHⅠ和EcoRⅠ位点，以常规方法提取的铜绿假单胞菌基因组DNA 为模板，PCR 扩增flgE基因，回收纯化后以和BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，转化入大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，提取质粒，以上述两种限制性核酸内切酶酶切鉴定，获得的阳性重组质粒即为含铜绿假单胞菌flgE基因的DNA 疫苗，命名为pcE。

1.4 灭活疫苗和菌毛蛋白疫苗的制备 制备铜绿假单胞菌悬液并调整其浓度为2×1010cfu/mL，经甲醛灭活后，加入总体积6 %的吐温-80 搅拌均匀后作为水相，以94 %的白油、6 %的司盘80 和2 %的硬脂酸铝作为油相，水相和油相按照1:2 的比例混合充分乳化制备铜绿假单胞菌灭活疫苗。向铜绿假单胞菌的菌体沉淀中加入1 mol/L 盐酸调整pH 值至2.0，室温磁力搅拌裂解细菌后离心收集上清液，并以NaOH 调整pH 值为7.2 后以硫酸铵沉淀法获得菌毛蛋白。测定并调整蛋白浓度后按照上述方式将水相和油相1:2 乳化制备铜绿假单胞菌菌毛蛋白疫苗，使疫苗中蛋白含量为1 μg/μL。

1.5 动物免疫 将6 周龄～8 周龄BALB/c 小鼠共140 只，随机平均分为7 组，分别为pcE 组(即DNA疫苗组)、菊粉灌胃组、菊粉佐剂组、灭活疫苗组、鞭毛蛋白组、pcDNA3.1(+)空载体组和PBS 阴性对照组。菊粉灌胃组以600 mg/kg 的剂量灌胃菊粉，连续灌胃20 d，期间其它各组正常饲养，灌胃结束后对各组小鼠进行免疫。DNA 疫苗组和菊粉灌胃组以100 μg/ 只的剂量免疫pcE 质粒；pcDNA3.1(+)组每只注射100 μg 空载体质粒；菊粉佐剂组为pcE 质粒中添加菊粉，使其终浓度为20 %，充分混匀溶解后以100 μg/ 只的剂量免疫小鼠；阴性对照组的小鼠，每只肌肉注射100 μL 1×PBS。上述各组均采用腿部肌肉注射。灭活疫苗与鞭毛蛋白疫苗注射于小鼠背部皮下，每只100 μL。以上各组均免疫3 次，每次间隔两周。具体分组及免疫成份见表1。

表1 动物分组Table 1 Animal groups

1.6 抗体水平检测 参照文献[2]间接ELISA 方法，免疫后每周采血至攻毒前，分离血清，分别以2×109cfu/mL 的铜绿假单胞菌菌体和20 μg/mL 的鞭毛蛋白为包被抗原包被酶标板，以待检血清(1∶100)为一抗， 羊抗小鼠IgG-HRP (1∶2 000)为二抗，测定免疫小鼠的血清抗体水平。

1.7 脾淋巴细胞增殖试验 分别于每次免疫后两周时各取两只小鼠脱颈迫杀，无菌采集脾脏制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为1×107个/mL，采用MTT法测定各组小鼠脾淋巴细胞的增殖水平。

1.8 脾淋巴细胞分泌IFN-γ 水平的检测 每次免疫后两周时分离并制备各组小鼠脾淋巴细胞，37 ℃5 %的CO2孵育72 h 后，吸取培养液，离心收集上清，利用小鼠IFN-γ 检测试剂盒，分别对免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ 水平进行检测。

1.9 动物攻毒试验 第3 次免疫两周后，各组小鼠以1.35×1010cfu/ 只腹腔注射铜绿假单胞菌进行攻毒，攻毒后继续饲养观察两周，记录各组小鼠的存活数，计算疫苗的保护率。

2 结 果

2.1 重组质粒的鉴定 以铜绿假单胞菌基因组为模板，采用特异性引物对flgE基因进行PCR 扩增，结果显示扩增得到约1 400 bp 的目的条带，与预期大小一致(图1A)，表明扩增得到flgE基因。随后将目的基因克隆于真核表达载体pCDNA3.1(+)中，构建重组质粒pcE，并以BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定，结果显示，经双酶切获得约1 400 bp 的DNA 片段，与预期大小一致(图1B)，表明重组质粒正确构建。

图1 flgE 基因的PCR 扩增(A)及重组质粒pcE 的双酶切鉴定(B)Fig.1 PCR amplification of flgE gene (A)and electrophoresis of the two enzymes digestion of pcE (B)

2.2 小鼠抗体检测结果 免疫后每周采血分离血清，分别以铜绿假单胞菌全菌体及鞭毛蛋白为包被抗原，利用间接ELISA 检测各组小鼠的血清抗体水平，结果显示，随着免疫次数的增加，除空载体组和PBS 组外，其它各疫苗组小鼠的血清抗体水平均呈现出逐渐上升的趋势。以全菌体为包被抗原时检测到的灭活疫苗组的抗体水平略高于鞭毛蛋白组，而以鞭毛蛋白为包被抗原时检测到的抗体水平则反之。以两种包被抗原检测到的菊粉灌胃组、菊粉佐剂组和DNA 疫苗组的血清抗体水平始终无明显差异(p＜0.05)，但均显著低于灭活疫苗组和鞭毛蛋白组(p＞0.05)(图2)。表明菊粉为佐剂和菊粉预先灌胃均对flgE基因DNA 疫苗诱导的体液免疫应答水平无明显促进作用。

2.3 小鼠淋巴细胞增殖试验结果 每次免疫2 周后，制备免疫小鼠脾淋巴细胞悬液，以铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白刺激后进行MTT 法检测，结果显示，一免后各疫苗组之间的SI 值无明显差异(p＞0.05)；二免和三免后灭活疫苗组的SI 值显著高于鞭毛蛋白组和菊粉佐剂组(p＜0.05)，极显著高于菊粉灌胃组和DNA 疫苗组(p＜0.01)，且鞭毛蛋白组和菊粉佐剂组的SI 值显著高于菊粉灌胃组和DNA 疫苗组(p＜0.05)，但鞭毛蛋白组和菊粉佐剂组之间则无显著差异(p＞0.05)(图3)。表明菊粉为佐剂可在一定程度上提高flgE基因DNA 疫苗诱导的免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖水平。

图2 免疫小鼠血清中抗体水平检测结果Fig.2 The levels of serum antibodies in immunized mice

图3 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况Fig.3 The splenic lymphocytes proliferation in immunized mice

2.4 小鼠IFN-γ 分泌水平的检测结果 每次免疫2 周后，制备各组小鼠脾淋巴细胞培养液，收集上清后检测IFN-γ 的分泌量。结果与淋巴细胞增殖试验类似，一免后，各疫苗组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ 的量无明显差异(p＞0.05)；二免和三免后，灭活疫苗组IFN-γ 的分泌量明显高于鞭毛蛋白组和菊粉佐剂组(p＜0.05)，极显著高于DNA 疫苗组和菊粉灌胃组(p＜0.01)，且前两者高于后两者(p＜0.05)(图4)。表明菊粉作为佐剂可以增强flgE基因DNA 疫苗诱导免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ 的能力。

图4 免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ 的水平Fig.4 The levels of IFN-γ in splenic lymphocytes of immunized mice

2.5 攻毒试验结果 各组小鼠于第3 次免疫后两周时以铜绿假单胞菌攻毒，继续饲养观察两周。攻毒结果显示，pcDNA3.1(+)组和PBS 对照组的小鼠全部死亡；灭活疫苗组小鼠无一死亡，保护率最高；菊粉佐剂组和鞭毛蛋白组保护率相当，高于菊粉灌胃组和DNA 疫苗组；且菊粉灌胃组的保护率高于DNA 疫苗组(表2)。表明菊粉作为佐剂和预先灌胃均可以提高flgE基因DNA 疫苗为小鼠提供的保护效果，且以菊粉作为佐剂时效果更优。

表2 动物攻毒试验结果Table 2 Protection of immunized mice against lethal challenge with Pseudomonas aeruginosa

3 讨 论

目前临床上尚无针对铜绿假单胞菌的可用疫苗，但对其疫苗的研究报道不在少数，包括DNA疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗等均有相关研究[3-5]。本实验以铜绿假单胞菌的flgE基因构建了DNA 疫苗，检测了该DNA 疫苗在小鼠体内诱导的免疫效果。flgE是铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白编码基因，是重要的保护性抗原基因之一。研究表明，多种病原菌的鞭毛蛋白均具有较好的免疫原性，可用于相关疫苗的研究[6-8]。林丹丹等在大肠杆菌中表达纯化了铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白，并在人角膜上皮细胞中检测了其活性[9]。Weimer 等的研究显示，铜绿假单胞菌的鞭毛蛋白可以增强OPRF/OPRI 表位疫苗诱导的免疫保护作用[10-11]。虽然目前对铜绿假单胞菌DNA 疫苗的研究较为多见，但以flgE基因构建DNA 疫苗的报道则相对较少。本课题组前期以铜绿假单胞菌的oprL和oprF基因构建了单价和融合DNA 疫苗，但结果显示其免疫效果仍难以超越灭活疫苗[12-13]。因此需要采取一定的措施进一步增强DNA 疫苗的免疫原性，如选择更加有效的抗原基因，采用疫苗佐剂等。

菊粉是一类天然的植物多糖，在体内可以被代谢成简单的果糖和葡萄糖，因此不会伴随有任何局部或全身的毒性，对人和动物来说都是一种安全的免疫佐剂[14]。研究显示菊粉对乙肝疫苗、李氏杆菌疫苗、流感疫苗等均有一定的免疫增强作用[15-17]。本课题组前期的研究也显示，以菊粉灌胃小鼠后可以提高小鼠的免疫器官指数、腹腔巨噬细胞吞噬能力、血清溶血素水平、脾淋巴细胞增殖水平和IFN-γ 分泌水平[18]。基于此，本实验对菊粉预先灌胃和菊粉作为佐剂时对铜绿假单胞菌flgE基因DNA 疫苗的免疫增强作用进行了检测。结果显示，无论以菊粉灌胃还是以菊粉为佐剂，对flgE基因DNA 疫苗诱导的血清抗体水平均无显著的促进作用，表明菊粉不能提高该DNA 疫苗诱导体液免疫应答的能力。然而淋巴细胞增殖试验和IFN-γ 分泌试验结果则显示，菊粉佐剂组小鼠的脾淋巴细胞增殖能力和IFN-γ 分泌水平均明显优于DNA 疫苗组和菊粉灌胃组，表明菊粉为佐剂可在一定程度上增强flgE基因DNA 疫苗诱导细胞免疫应答的能力，但菊粉预先灌胃则无此作用。攻毒试验结果也表明菊粉作为佐剂可提高flgE基因DNA 疫苗的保护效果，虽然菊粉预先灌胃对该DNA 疫苗诱导的体液和细胞免疫应答水平均无明显影响，但仍可在一定程度上提高其为小鼠提供的免疫保护效果，其原因需进行进一步的研究。