微分离技术研究寒地丁香胚珠的发育机制

张馨默，刘丽萍*

（1.黑龙江大学/农业微生物技术教育部工程研究中心；2.黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室，黑龙江哈尔滨150000）

丁香的雌配子体（megagametophyte）是丁香胚珠的主要核心结构，利用微分离技术制片观察丁香雌配子体减数分裂行为的发生机制。减数分裂是丁香胚珠发育过程中的关键时期。丁香雌配子体的成熟和卵细胞的正常发生，可对寒地丁香的生长生殖和发育起主导作用。因此，对寒地丁香大孢子母细胞时期的胚珠发育机制进行研究，具有重要的理论和实践意义。

目前，调控胚珠发育的分子机制已见报道，但利用微分离技术对丁香大孢子母细胞的发育机制进行的相关研究尚未见报道。课题组在微分离丁香胚珠的过程中发现丁香的胚囊有分隔，并一分为四，隔为十字交叉，每个隔内都有1个胚珠，认为这一现象是多种基因共同调控表达的结果。是丁香的功能基因综合表达的产物，直接体现丁香生长发育的调控特点。因此，本文采用形态学、解剖学和细胞学等研究手段，对寒地丁香雌配子体有丝分裂期的胚珠进行制片研究，以揭示寒地丁香雌配子体有丝分裂调控机制。

研究结果：对寒地丁香的大孢子母细胞发生发育过程中的形态学和解剖学特征进行了系统观察，准确掌握了丁香胚珠发育的数量，得到主要结果如下，当寒地丁香花絮约为8.0 mm时，腋芽原基发育，入冬后花芽休眠。至第2年春季4～5月，花絮约为6.0 mm时，胚珠细胞分化。在胚囊约为5.0 mm时，大孢子母细胞分化；约为11.0 mm时，胚珠体细胞中当雌配子体开始形成细胞壁时，颈卵器原始细胞分化；约为43.0 mm时，颈卵器、卵细胞发育成熟，雌配子体细胞化完成；约为45.0 mm时，受精作用发生。胚囊内即可观察到成熟胚。在丁香大孢子母细胞的发生发育过程中对处于雌配子体旺盛分裂期的丁香胚珠进行了微分离技术的分离分析。最终在上百个胚囊中分离胚珠大约400个。有30个胚珠中处于雌配子体分裂前、后期的丁香胚珠。它们在有丝分裂期，胚珠内的物质供给短缺和能量代谢异常共同导致了蛋白质合成和DNA复制发生异常。在胚珠遭受氧化胁迫时，与细胞信号转导相关的蛋胚珠细胞最终开启了细胞程序化死亡进程，导致雌配子体游离核有丝分裂失败。

我国对丁香的研究主要集中在新品种培育和栽培管理等方面，而对丁香胚珠解剖及微分离方面的研究几乎是空白。本次实验将结合观测丁香花、叶的组成结构的数据、微分离制片观察技术明确丁香花的胚珠数、各部位结构，以便研究丁香的生殖发育特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本次实验的材料为丁香，主要对丁香的胚珠进行微分离以及花粉的形态进行观测和解剖研究。

1.2 方法

1.2.1 花的解剖方法 利用人工方法对丁香花的外部形态（花瓣、花萼、花托、花柱等）进行解剖测量和观察，通过多组实验求平均值（见表1）。

表1 丁香花卉的测量（平均值）（单位：cm）

1.2.2 花粉制片方法 取样，解剖镜分离丁香的花药进行制片，经改良品红染色，普通光学显微镜观察。丁香花粉呈单粒存在，为椭圆形细胞，被染成淡紫色，拍照保存。

1.2.3 叶片徒手切片方法徒手切片是将新鲜的或固定的实验材料制成薄片的方法。切片时需要用左手固定好丁香的叶片，一般叶片需要伸出食指2～3mm，避免切到手指。右手在切片的时候需要与实验材料保持垂直。注意用力的时候应使用臂力而不是手腕的力气，时刻保持切面的湿润，必要时需要向切面上滴加清水。徒手切片法具有简便、迅速、易操作的优点，并且容易观察到植物组织的天然色泽与结构。有利于研究植物解剖结构，同时，它具有利于临时观察、能更快得到实验结果[1]。

1.2.4 叶片染色方法 用番红染液染色，将切片放入1%番红染液染色10min，后用无水乙醇洗去浮色；再用0.1%固绿染液染近20s，用无水乙醇洗去浮色，封片观察。用苏木精染色，将材料放入1%苏木精染液染色5min，后用无水乙醇洗去浮色；再用0.1%固绿染液染色近20s，用无水乙醇洗去浮色，封片观察。

2 结果与分析

2.1 形态特征

丁香的花为伞状花序，每个花序有小花7朵，花顶端呈伞形排列，花呈漏斗状，花瓣有宽瓣，亦有细瓣，喇叭状，使丁香看起来花团锦簇。丁香的花色以淡紫色为主，并且每朵花有4片花瓣、4个雄蕊、1个雌蕊。其花粉粒饱满，呈圆形，单粒，传粉简单，花期4～5月。观赏价值极高，受到大众喜爱。

2.2 胚珠的形态特征

利用微分离技术分离丁香花的子房可得到胚珠，其子房下位，共4室，每室有1个胚珠。丁香胚珠的形态为直生型，即珠孔与珠柄在一条直线上。属中轴胎座，厚珠心，胚囊发育的类型为蓼型。

2.3 胚珠发育机制实验结果

2.3.1 胚珠的发育 受精前，胚珠由珠心、珠被、珠孔、珠柄组成，其中珠柄与胎座连接。在靠近珠心的位置逐渐生长出珠被，一般是内珠被早于外珠被出现，最终珠被将珠心包围只留下一孔，即珠孔。丁香的胚珠在发育的过程中，一般保持直生。

2.3.2 大孢子的发生大孢子的发生始于珠心表皮下分化的一个孢原细胞，这个细胞与其他细胞不同的是它的体积较大且细胞核明显、胞质浓厚。在厚珠心的胚珠中，孢原细胞一般进行平周分裂，产生一个周缘细胞和一个造孢细胞，其中造孢细胞将起大孢子母细胞的作用，进行减数分裂，最终形成4个单倍体数目的大孢子。通常除合点端的大孢子外，其余的3个大孢子逐渐退化[2]。

2.3.3 雌配子体的发育 丁香的胚囊也称雌配子体，一般由7个细胞组成，即2个助细胞、1个卵子、1个带有两个极核的中央细胞、3个反足细胞。在胚囊的发育过程中，通常只有合点端的功能大孢子发育成胚囊，其依次经历细胞的体积变大、出现液泡、连续3次的核分裂，最终形成的8个核会处于共同的细胞质中。因此，丁香的胚囊通常是由8个细胞核构成7个细胞的蓼型结构[3]。

3 结论

通过利用微分离技术对寒地丁香胚珠的发育机制的研究，确定丁香胚囊有分隔，每个隔有1个胚珠，一个胚囊共有4个胚珠。丁香为伞状花序，花粉粒为圆形。花朵繁多，观赏价值高[4]。花的颜色为淡紫色和淡粉色，花瓣的基底部为乳白色，花形状为漏斗状。丁香叶近心形，叶片上、下表皮细胞外壁均被有厚角质层，气孔器的保卫细胞为肾形，具有发达的储水组织；叶肉细胞同型，平行脉，维管束具有维管束鞘，上下表皮均有栅栏组织分布。光合作用输送有机营养的能力强。这也验证了叶的生物学特征：叶片革质，质地硬度大的特点。叶的薄壁细胞分布广泛[5]。因此，可适当减少花的浇灌次数，便于种植。同时，也观察到了螺纹导管等细胞结构，疏导能力较强。表皮层角质层较发达。叶绿体细胞较小，丁香的形态和解剖结构能够说明其具有耐阴、耐干旱等植物特性。花粉粒形态观察结果为圆形，有待进行深入的研究观察丁香花粉的减数分裂行为等。丁香的根系比较发达有分支，肉质纤维状，利于水分和无机盐的输送。本项研究为寒地丁香种质资源的研究提供一定的参考依据。