贮藏温度对即食小龙虾品质及微生物菌群多样性的影响

周 涛 吴晓营 - 罗海波 - 满文曾 - 王 芮 万辰玥 -

(南京师范大学食品与制药工程学院，江苏 南京 210097)

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)又名小龙虾、红螯虾，其肉质鲜美、风味独特、营养价值高，是中国目前市场上最畅销的淡水虾类[1]。现已形成了集“苗种繁育、健康养殖、加工出口、餐饮物流、节庆文化”于一体的产业链条[2]。目前，中国淡水小龙虾主要以生鲜销售、冷冻粗加工和即食产品为主，即食小龙虾产品改变了季节性对其销售和消费的限制，但也存在货架期短等问题。水产品腐败变质主要归结于细菌的侵染，随贮藏时间的延长，只有少数特定种类的微生物迅速增长，并逐渐占据主导地位，生长代谢产生一些不良物质，导致产品腐败变质，这类细菌就是特定腐败菌(specific spoilage organisms，SSO)[3-5]，如果能对产品中特定腐败菌进行控制即可有效延长货架期。所以有必要了解产品在贮藏过程中菌群结构与变化规律，对引起产品变质的特定腐败菌进行研究，从而达到靶向抑制产品腐败变质的目的。

近年来，随着分子生物学的发展，高通量测序技术已被广泛应用于分析微生物菌群多样性的变化。高通量测序是一种非培养分析法，无需对菌株进行培养，可以直接通过提取、分析样品的DNA来对微生物多样性进行分析[6]，目前已成功应用在鲳鱼[7]、蟹糊[8]、带鱼[9]、虾夷扇贝柱[10]、南极磷虾[11]、牡蛎[12]等水产品中微生物菌群多样性的分析。江杨阳等[13]同时利用传统培养方法和高通量测序技术对冷藏小龙虾进行优势腐败菌的分析，但通过该技术对小龙虾即食产品菌群多样性进行分析的尚未见报道。试验拟将即食小龙虾产品置于两种常用贮藏温度下，旨在了解产品在不同贮藏温度下品质及菌群多样性变化，为企业在杀菌参数确定、车间卫生管理、靶向抑制产品腐败变质及研发防腐保鲜技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小龙虾：购于江苏盱眙水产市场；

平板计数琼脂(PCA)：海博生物技术有限公司；

细菌基因组DNA提取试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

硼酸、MgO：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

高纯度耐热DNA聚合酶：南京诺唯赞生物科技有限公司；

DNA产物纯化试剂盒：北京全式金生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

自动凯氏定氮仪：K9840型，海能仪器有限公司；

PCR仪：T100TM Thermal Cyeler型，美国BIO-RAD公司；

电泳槽：DYCZ-21型，北京市六一仪器厂；

凝胶成像系统：EC3 500型，美国UVP公司；

漩涡混合器：GL-88B型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

移液器：Research型，0.5～10.0 μL，德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的加工工艺

鲜活小龙虾→盐水吐污6 h→机械清洗、挑选鲜活小龙虾→油炸→调味煮制→冷却→真空包装→灭菌(100 ℃，20 min)→即食产品

1.3.2 样品的处理 样品分别贮藏于25，4 ℃条件下，分别每隔2，5 d取虾肉样品(去头、去壳、去虾线)测定其理化指标。

1.3.3 微生物菌落总数的测定 按GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》执行。

1.3.4 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定 按GB/T 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》的自动凯氏定氮仪法执行。

1.3.5 DNA的提取 分别选取两个贮藏温度下中、末期的小龙虾虾肉(去头、去壳、去虾线)，利用液氮研磨的方法处理后，提取样品总DNA。

1.3.6 PCR扩增 以提取的基因组DNA作为模板，参照江艳华等[10]的扩增条件对16S rDNA序列的V3-V4可变区域进行扩增。引物序列如表1所示。扩增结束后，检测DNA分子质量，质量满足要求的送至生工生物工程(上海)股份有限公司通过高通量测序技术做进一步分析。

1.3.7 数据处理 Miseq测序系统测序序列中含有标签序列，以及测序时加入的引物和接头序列。首先将成对的测序序列拼接成一条序列，随后根据标签序列区分样品得到各样本数据，对各样本序列进行质量控制，过滤掉质量不符合要求的序列[14]。将多条序列进行聚类分析，一般将相似性>0.97的序列进行归并，生成操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)。根据聚类分析结果，计算得到ACE、Chao1、Shannon、Simpson指数，进行Alpha多样性分析，其中ACE、Chao1指数是对菌群丰度进行评估，Shannon、Simpson指数是对菌群多样性进行评估[15]。基于分类学分析对比结果，来讨论小龙虾即食产品在不同贮藏温度、时间条件下菌群结构及变化规律。

1.3.8 数据分析 每组试验进行3次平行。应用Excel 2010软件对数据进行整理、绘图；应用Prinseq 0.20.4、Pear 0.9.6、Cutadapt 1.2.1软件对各样本数据进行质控过滤，得到样本有效数据；应用Usearch 5.2.236、Mothur 1.30.1、R 3.2等软件对样本进行OTU聚类、Alpha多样性和菌群多样性分析。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 小龙虾即食产品在不同贮藏温度下的品质变化

2.1.1 菌落总数 不同贮藏条件下小龙虾即食产品菌落总数变化见图1、2。Al-Dagal等[16]研究表明：虾类产品分两个鲜度，其菌落总数<5.00 lg(CFU/g)为一级鲜度，在5.00～5.70 lg(CFU/g)的为二级鲜度，当>5.70 lg(CFU/g)时已经腐败不能再食用，即到达货架期末期。

由图1、2可知：两个贮藏温度下，菌落总数均呈增长趋势，25 ℃条件下增长速度较快，几乎呈直线增长趋势，第6天菌落总数指标已超过二级鲜度，到达理论腐败期，第8天时菌落总数已远远超过5.70 lg(CFU/g)，酸臭味强烈，达到可接受的极限；4 ℃贮藏条件下，前期菌落总数增加缓慢，第15天开始增长速度加快，第35天时已超过虾类产品的二级鲜度指标，达到理论腐败值。

图1 25 ℃贮藏温度下小龙虾即食产品菌落总数和挥发性盐基氮的变化

Figure 1 The change of total numbers of colony and volatile basic nitrogen on conditioning crayfish during 25 ℃storage

图2 4 ℃贮藏温度下小龙虾即食产品菌落总数和挥发性盐基氮的变化

Figure 2 The change of total numbers of colony and volatile basic nitrogen on conditioning crayfish during 4 ℃storage

初步推断25 ℃贮藏条件下贮藏期为6 d，4 ℃贮藏条件下贮藏期为35 d。

2.1.2 TVB-N值 小龙虾蛋白含量较高，死后其蛋白质等含氮物质在酶和微生物的作用下会分解成挥发性氨以及低级胺类等化合物，即挥发性盐基氮(TVB-N)[17]。根据GB 10136—2015《动物性水产制品》规定，动物性食品中TVB-N值≤30.00 mg/100 g为合格品。即食小龙虾贮藏期间TVB-N变化如图2所示。

由图1可知， 25 ℃贮藏温度下，TVB-N含量几乎呈直线增长，第6天时TVB-N值已达到28.94 mg/100 g，临近GB 10136—2015规定的限值，第8天已远远超过限值。结合第6天的菌落总数为5.74 lg(CFU/g)，已超过虾类产品的二级鲜度指标。可看出TVB-N值作为鲜度判定要比菌落总数值滞后，与前人对哈氏仿对虾[18]和冷藏小龙虾[13]的研究结果一致，故综合两指标认为25 ℃贮藏温度下货架期为6 d。中期样品取第3天的龙虾肉(记为C3)，末期样品取第6天的龙虾肉(记为C6)。

由图2可知，4 ℃贮藏温度下，前期增长缓慢，后期几乎呈直线增长，与后期微生物数量大幅度增加有较大关联，微生物分解蛋白质从而产生挥发性氨以及低级胺类等化合物，使得TVB-N值增加。在第30天时TVB-N值接近GB 10136—2015规定的限值，第35天时稍超过限值，结合菌落总数变化情况，将第35天视为贮藏末期。中期样品取第15天的龙虾肉(记为B15)，末期样品取第35天的龙虾肉(记为B35)。

2.2 小龙虾即食产品在不同贮藏温度下的菌群变化

2.2.1 基因组DNA提取及PCR扩增 分别取不同贮藏温度下中期和末期的龙虾肉4份，利用液氮研磨的方法提取其总DNA，经PCR扩增V3-V4可变区后琼脂糖凝胶电泳检测其质量。如图3所示各样品目的片段条带清晰，满足后续测序试验要求。

M. DNA分子量标准 1. B15 2. B35 3. C3 4. C6

2.2.2 测序序列分析 为了保证信息分析质量，必须对杂合的DNA片段(即嵌合体)进行剔除，去除嵌合体与靶区域外序列统计表见表2。从表2可看出，经质控和优化后每个组的有效序列数均在30 000以上，有效序列的百分比达89.00%以上，C6样品达到99.77%。覆盖率作为样本完整性指标，表示样品中总物种的百分比[19]。4个样品的覆盖率均在0.99以上，表明所得有效序列可达到后续分析的要求。通过比对4个样品的OTU数量可知，随贮藏时间的延长，OTU数量下降，物种丰度下降。

表2 各组样品有效序列与OTU数量统计

2.2.3 Alpha多样性分析 使用Ace、Chao1、Shannon及Simpson指标对微生物菌群的丰富度及其个体分配均匀性进行评估[20]。由表3可知，两种贮藏温度下，中期阶段25 ℃ 条件下菌群多样性更高，Ace、Chao1、Shannon 3个指标变化较大，但Simpson并无变化，均为0.05，可能是Simpson数值主要综合体现物种的丰富度和均匀度，在考虑种类数目变化的同时，还考虑了种类之间的配比变化[13]。随贮藏时间延长，物种丰度和多样性均下降，尤其常温条件下菌群丰度指标急剧下降，证实了贮藏后期优势腐败菌属的大量存在，产生不良代谢物影响其他菌种生长，从而使得物种多样性降低。

表3 小龙虾不同贮藏时期菌群的Alpha多样性比较

根据以上数据可得到稀释曲线(图4)。稀释曲线可用来评估样品中物种的丰富度，也可通过观察直线是否趋于平缓来判断样本的测序数据量是否合理。如图4所示，在横坐标刚开始，曲线便趋于平缓，说明测序数量已足够。

图4 Shannon稀释曲线分析

2.2.4 菌群多样性分析 采用该RDP classifier方法对样品获得的OTU进行属水平上的物种分类。4个样品中主要属水平下分类见表4。由表4可知，不同贮藏温度、时期，菌群结构有较大差异。贮藏中期除去未分类菌群，两种贮藏温度下丰度最大的均为棍状厌氧菌属(4 ℃条件下：18.239%；25 ℃条件下：3.595%)；贮藏末期，4 ℃贮藏条件下优势菌群为海洋杆菌属(Oceanobacillus，81.522%)和希瓦氏菌属(Shewanella，3.625%)，25 ℃贮藏条件下优势菌群为哈撒韦氏菌属(Hathewaya，78.700%)、芽孢杆菌属(Bacillus，12.380%)和狭义梭菌属(Clostridiumsensustricto，8.707%)。不同的贮藏条件下微生物耐受力不同，故后期菌群结构存在差异。

表4 不同贮藏温度及时期样品菌群在属水平上的分布†

† 菌属1～3为目前无中文名或统一名称的菌属。

棍状厌氧菌属(Anaerorhabdus)是一种肠杆菌，蔡丽萍等[20]在野生锯缘青蟹肠道中也检出了该菌属为优势菌群。可能是小龙虾自身所携带的菌体，加工处理过程中未完全灭活或被二次污染使之成为贮藏中期主要菌属。但随贮藏时间的延长，该菌属丰度逐渐降低，尤其在25 ℃ 条件下丰度降为0，可能是后期环境不适宜其生长或优势腐败菌的出现抑制其生长。

哈撒韦氏菌属(Hathewaya)和海洋杆菌属(Oceanobacillus)在腐败末期占据主要地位。哈撒韦氏菌属之前被定义为梭状芽孢杆菌属类群二[21]，革兰氏阳性菌，优先分解蛋白，最适生长温度30 ℃左右，最适pH值6.0～8.5[22]。25 ℃贮藏条件下温度、pH正适合哈撒韦氏菌属的生长，且龙虾是高蛋白产品，后期蛋白分解，使得丰度增长到78.700%，成为25 ℃贮藏末期主要的菌属。海洋杆菌属是与芽孢杆菌属相关的新菌属[23]，呈革兰氏阳性，是一种耐盐亲碱菌。Lu等[24-25]曾在一种深海生物中分离出海洋杆菌属，Yumoto等[26]也曾在淡水湖里虹鳟的鱼皮中分离出海洋杆菌属。海洋杆菌属在冷藏末期相对丰度达81.522%，表明其可能在产品腐败变质过程中起到重要作用，但中国有关此菌属的研究较少，后续研究应重点关注。

希瓦氏菌属(Shewanella)和芽孢杆菌属(Bacillus)是常见的水产品中腐败菌属。希瓦氏菌属代谢能力极强，能适应多种盐浓度、温度及气体环境，是一种嗜冷性菌属，故在冷藏期间丰度增加，成为优势菌属之一。其模式菌种为腐败希瓦氏菌，作为冷藏海水鱼中主要腐败菌被人们熟知，但随着研究的深入，在淡水养殖动物中也陆续被发现[27]。芽孢杆菌属大多来源于土壤和空气中，可能是小龙虾在淤泥中生长，自身感染或在后期加工过程中二次污染所残留的耐热芽孢杆菌，常规杀菌方法难以将其杀灭，在适宜条件下再次生长。此外，还有一些菌属虽然相对丰度较小，但可能在产品腐败变质过程中也起重要作用。

已有研究[28]表明，水产品中主要的优势腐败菌有弧菌属(Vibrionaceae)、肠杆菌属(Enterobacteriaceae)、假单孢菌属(Pseudomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、乳酸菌(Lacticacidbacteria)、芽孢杆菌属(Bacillus)及梭状芽孢杆菌属(Clostridium)等，不同水产品的腐败菌种类也大不相同。小龙虾的品种、生长环境和后期加工均会使得优势腐败菌有所不同[5]，故在研发产品保鲜剂时，应针对具体的产品、加工和贮藏条件，综合考虑各种影响因素。此外，低温杀菌虽然对产品肉质影响较小，但具有一定局限性，难以杀死产芽孢的细菌。为了不影响肉制品口感、风味可采用其他温和且安全的杀菌方式，例如辐照杀菌技术或其他的物理杀菌方法，避免对含芽孢的菌属灭菌不彻底，使得后期再次生长。总之，最好采取物理、化学和生物方法相结合的方式有针对性地进行防腐保鲜技术的研究，达到延长产品货架期、保障产品卫生安全的目的。

3 结论

试验对不同贮藏温度下即食小龙虾品质及菌群结构进行了研究。结果表明：产品在25，4 ℃条件下的货架期分别为6，35 d；随着贮藏时间的延长，菌群多样性降低，并出现了优势腐败菌，但两种贮藏温度下优势腐败菌各不同；低温杀菌存在一定局限性，食用前最好经过微波加热。研究通过高通量测序技术分析了贮藏中期和末期菌群在属水平上的变化，但无法确定到具体的腐败菌种，下一步可用传统培养方法对末期样品中腐败菌进行分离纯化，深层次地研究其生长条件和腐败特性，从而有针对性地抑制产品的腐败变质。另外在研究即食小龙虾加工和保鲜的过程中，需综合考虑各种影响因素，进一步探索安全且有效的杀菌方式和保鲜技术，保证即食小龙虾的食用安全性，扩大消费市场。