樟树叶精油抗PM2.5致肺上皮细胞损伤的研究

熊国红 - 林 海 何建国 - 李应洪 - 付湘晋 -

(1. 益阳市产商品质量监督检验研究院，湖南 益阳 413000；2. 中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

悬浮于空气中的固态和/或液态微粒中空气动力学当量直径≤2.5 μm的颗粒物被称为PM2.5。肺上皮细胞是最直接接触PM2.5的细胞之一，已有大量研究PM2.5对肺上皮细胞的损伤及机制的报道[1]。PM2.5通过：① 引起细胞内大量生成ROS 等自由基；② 激活NF-κB等炎性信号通路引起炎症因子大量生成，最终导致细胞凋亡或者坏死[2-3]。据翟文慧等[1]报道，随着PM2.5浓度升高、染毒时间延长，肺上皮细胞(A549细胞)中炎性因子IL-6、TNF-α表达水平显著升高(P<0.05)；刘涛等[4]报道，PM2.5能够造成肺上皮细胞A549的氧化损伤、炎性损伤和DNA链断裂。在环境污染近期很难彻底治理好的现实情况下，如何避免、预防PM2.5损伤人体，已经引起人们的普遍关注[5]。

目前有大量从抗氧化、抗炎症角度筛选PM2.5拮抗剂的研究[6]。如大鼠口服维生素E后肺泡灌洗液中的氧化性指标LDH、MDA、ACP和AKP水平有所下降，可在一定程度上拮抗由PM2.5引起的大鼠肺组织细胞的氧化损伤[7]。王鹤潼等[8]发现复方精油可能通过抑制TLR4/MyD88通路及NLRP3炎症小体活化减少IL-1β表达并抑制Th免疫反应从而减轻PM2.5所致的急性肺炎。N-乙酰半胱氨酸(NAC)可抑制由PM2.5激活的NF-κB信号通路，降低血清和肺组织中炎性因子的表达，提高大鼠的抗氧化能力，减轻PM2.5所致肺损伤[9]。也有文献报道发现一些天然产物可显著拮抗PM2.5诱导A549细胞凋亡，如绿原酸、阿魏酸和荭草素[4]、竹叶提取物、红豆越橘提取物[10]。

樟树叶精油有一定的抗氧化活性和很好的抗炎活性[11]，对肺部疾病有明显的治疗作用[12]。所以，樟树叶精油也可能对PM2.5致细胞损伤有拮抗作用，但目前还未见相关报道。而且，精油可做成气体剂型，比上述研究所用到的口服剂型可能更易直接作用于肺部。由于肺Ⅱ型上皮细胞在体外不能传代，人肺癌(A549)细胞具有肺Ⅱ型上皮细胞特性[13]，所以，试验拟采用A549细胞进行试验研究，以探究樟树叶精油对PM2.5所致A549细胞损伤的拮抗作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樟树叶精油：以采于厦门牡丹香化有限公司基地的樟树叶为原料，利用亚临界萃取法萃取的精油；以正丁烷为萃取溶剂，萃取压力8 MPa，萃取温度50 ℃、萃取解析温度70 ℃，萃取时间50 min；试验所用的是桉油素型，主要成分包括β-月桂烯(0.86%)、石竹烯(4.75%)、α-石竹烯(2.62%)、桉叶油醇(24.74%)、α-萜品醇(1.07%)、芳樟醇(5.82%)、棕榈酸(8.55%)、亚油酸(4.30%)、9,12-十八碳二烯酸(6.83%)等；

A549细胞株：中国医学科学院细胞中心；

胎牛血清：天津市财慧生化制品厂；

PMI1640细胞培养基：美国Gibco公司；

CCK-8试剂盒：日本同仁化学研究所；

细胞裂解液、蛋白浓度测试盒：碧云天生物技术研究所；

胰蛋白酶：酶活2 500 U/mg，美国Sigma公司；

IL-6、TNF-α酶联免疫试剂盒：美国R&D公司；

MDA、SOD、CAT、T-AOC测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 试验仪器

大流量采样器：G1200型，美国Andersen公司；

真空冷冻干燥机：LGJ-10型，北京松源华兴科技发展有限公司；

冷冻离心机：TGL-16GR型，上海安亭科学仪器厂；

酶标仪：550型，美国伯乐(Bio-Rad)公司。

1.3 试验方法

1.3.1 颗粒物样品的采集、处理 采样时间为2016年1月，采样地点位于长沙某城区，采样位置离地面高度约10 m，使用G1200型大流量PM2.5采样器(采样流量1 m3/min)连续24 h收集大气颗粒物，使用QM-A型石英纤维滤膜吸附颗粒物，采样后的滤膜用铝箔纸包好。

将吸附有PM2.5的滤膜浸泡入去离子水中，超声处理20 min洗脱出颗粒物，将颗粒物样品真空冷冻干燥24 h，称重，加入PBS配制成不同浓度的PM2.5悬液，高压灭菌，2～8 ℃冰箱保存，临用前超声15 min充分混匀。

1.3.2 PM2.5染毒剂量的确定 将生长状况良好的对数期细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，配成2×105mL-1的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔1 mL，用37 ℃、5% CO2培养24 h，加入50，150，200，250，300 μg/mL的PM2.5悬液并继续培养24 h，然后吸去细胞培养液，加入按1∶9稀释的CCK-8溶液100 μL，加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀，酶标仪检测450 nm处吸光度(OD)值，计算细胞存活率，以存活率50%左右的PM2.5悬液浓度为后续试验染毒剂量。

1.3.3 精油对A549细胞的保护作用 试验分为空白对照组、PM2.5损伤组和精油保护组。用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的A549细胞，用浓度10%胎牛血清的PMI1640细胞培养液，调整细胞密度2×105mL-1，1 mL/孔，接种到24孔培养板，培养24 h。试验组加入0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，10.00 mg/mL的精油预保护6 h，弃上清液，加入200 μg/mL PM2.5 继续作用20 h，PM2.5损伤组只加入200 μg/mL PM2.5，空白组只加入等量的PBS；然后吸去细胞培养液，加入按1∶9稀释的CCK-8溶液100 μL，加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀，酶标仪检测450 nm处吸光度(OD)值，计算细胞存活率。

1.3.4 细胞存活率计算

(1)

1.3.5 细胞内MDA、SOD、CAT、T-AOC水平测定 用直径10 cm培养皿培养细胞，精油处理后收集细胞，用4 ℃ 的PBS洗涤2遍，用细胞裂解液裂解，冷冻离心(4 ℃，1 600×g)10 min，取上清液；根据试剂盒方法测定MDA含量、SOD活性、CAT活性、T-AOC，同时测定蛋白浓度，校正细胞内MDA、SOD、CAT、T-AOC 水平。

1.3.6 炎性因子水平测定 吸取细胞培养上清液按照试剂盒方法说明进行细胞炎性因子水平测定，同时测定蛋白含量，校正细胞炎性因子水平。

1.4 数据处理及分析方法

采用SPSS 20.0统计分析软件，计数资料组间比较采用X2检验；计量资料用(均数±标准差)表示，采用方差分析比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 PM2.5对A549细胞的毒性

从表1可以看出，PM2.5对细胞的增殖有明显的抑制作用，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着浓度的增加，A549存活率逐渐降低。半致死剂量约在200 μg/mL，所以，后续染毒试验均采用200 μg/mL。

表1 PM2.5剂量对A549细胞增殖的影响†

† 同列字母不同代表有显著差异(P<0.05)。

由表1可知PM2.5浓度为0.20 mg/mL时，A549细胞存活率为(52.8±2.8)%，与文献[10]报道基本一致。

2.2 樟树叶精油对A549细胞增殖及存活率的影响

从表2可以看出，樟树叶精油安全性非常高，1.0 mg/mL以内对细胞增殖无影响，低浓度有一定促进作用；但当浓度>5 mg/mL时，对A549细胞有抑制作用。祖桂芳等[10]报道，竹叶提取物对细胞增殖的影响表现为低浓度(0.05，0.10 mg/mL)有促进细胞增殖的作用，而高浓度(0.20 mg/mL以上)有一定程度的抑制作用；红豆越橘提取物对细胞增殖的影响表现为浓度在0.05～0.40 mg/mL时可明显促进细胞增殖，细胞存活率最高达255%，而当浓度达到0.80～3.20 mg/mL时才显示出抑制细胞增殖的作用。所以，樟树叶精油对A549细胞增殖的影响与竹叶提取物、红豆越橘提取物类似。

从表2可以看出，0.05～1.00 mg/mL樟树叶精油对PM2.5所致的细胞毒性作用有显著的拮抗作用(P<0.05)；但添加量达到5.0 mg/mL时，保护作用消失。樟树叶精油在高浓度时对细胞的抑制作用可能与其主要成分桉叶油醇的细胞毒性有关。

表2 樟树叶精油浓度对A549细胞存活率的影响

† 同列字母不同代表有显著差异(P<0.05)。

2.3 樟树叶精油对A549细胞胞内氧化应激的影响

氧化损伤是PM2.5细胞毒性的主要机制之一。丙二醛(MDA)含量、SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)等是表征细胞氧化还原状态最常用的指标。MDA是最常见脂质过氧化产物，其含量广泛用于反映细胞脂质氧化程度。SOD、CAT、GSH-Px是细胞的抗氧化防御系统重要组成部分，可阻止活性氧的产生或者清除活性氧[14]。从表3 可以看出，PM2.5损伤细胞后MDA 含量显著增高(P<0.05)。刘婷等[15]发现，PM2.5损伤肺巨噬细胞24 h，细胞内SOD、CAT活性和T-AOC均明显降低，大于33 μg/mL的PM2.5可使MDA显著升高(P<0.05)。表3还表明，樟树叶精油可显著降低染毒细胞中MDA含量，增加SOD、CAT活性和T-AOC含量(P<0.05)，表明樟树叶精油可通过抗氧化应激拮抗PM2.5致细胞毒性。

2.4 樟树叶精油对A549细胞炎性因子的影响

PM2.5浓度升高及暴露时间延长可能导致机体炎症反应增强，从而造成机体损害[16]。TNF-α、IL-6均为介导炎症反应的重要介质，由单核巨噬细胞、自然杀伤细胞等分泌。TNF-α是机体炎症介质连锁反应中的启动因子、中心介质[17]。TNF-α能调节IL-1、IL-6等其他细胞炎症因子的释放。IL-6是急性炎症反应的主要标志物之一，来源于多种细胞[18-19]。因此，检测肺上皮细胞A549的IL-6、TNF-α含量，可以推断樟树叶精油拮抗PM2.5致肺上皮细胞炎性反应的机制。

表3 樟树叶精油对A549细胞中MDA、SOD、CAT和T-AOC的影响†

† 同列字母不同代表有显著差异(P<0.05)。

由表4可以发现：樟树叶精油可显著降低染毒细胞中炎性因子TNF-α、IL-6的含量(P<0.05)；表明樟树叶精油可通过抑制炎症反应拮抗PM2.5致细胞毒性。此前，焦周光等[20]研究发现，在染毒浓度为100 μg/mL及以上时，PM2.5可使细胞IL-6分泌量显著增加。试验获得类似结果。

表4樟树叶精油对炎性因子TNF-α、IL-6含量的影响†

Table 4 Effects of camphor leaves’essential oil on PM2.5(0.2 mg/mL)induced TNF-αand IL-6(n=3)

组别TNF-α/(pg·mL-1)IL-6/(pg·mL-1)空白140±10e70±10dPM2.5600±30a230±20a精油0.05 mg/mL310±10b140±20b精油0.10 mg/mL200±10d70±10d精油0.50 mg/mL220±20cd80±10cd精油1.00 mg/mL250±10c90±10c

† 同列字母不同代表有显著差异(P<0.05)。

3 结论

樟树叶精油安全性较高，1.0 mg/mL以内对细胞增殖无影响；0.05～1.00 mg/mL樟树叶精油对PM2.5所致的细胞毒性作用有显著的拮抗作用(P<0.05)。通过抗氧化应激及抑制炎症反应可能是樟树叶精油拮抗PM2.5致细胞毒性的机制。但由于樟树叶精油成分复杂，其准确的活性成分还需要进一步研究确认。