抹茶茶汤感官理化特性、多酚组成及抗氧化活性研究

张祺祺 - 程俊侠 - 王 琦 王浩鹏 -杨 娜 郭俊彤 - 邵红军 -

(1. 陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119；2. 陕西省绿色食品制造与安全控制实验室，陕西 西安 710119；3. 陕西省环境监测中心站，陕西 西安 710043)

抹茶是采摘覆盖遮阴栽培的优质鲜茶叶，经蒸青、烘干和研磨而成的超细绿茶粉末[1]。相对普通绿茶，栽培期间的遮阴处理有利于茶叶中叶绿素和茶氨酸的积累，改善其风味品质。加之蒸青和低温研磨处理，使得抹茶具有独特的感官品质和营养保健功效[2]。如Weiss等[3]报道，抹茶中高活性的表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)含量是高品质绿茶的137倍，比文献报道的其他绿茶也高出2～3倍。这与抹茶以鲜嫩叶为加工原料直接相关，鲜嫩茶叶的EGCG含量比老叶的高，经遮阴处理的叶片也比未经遮阴的含有更多的茶多酚[4]。已有研究[5-7]表明，抹茶具有改善血液流动、改善心血管疾病、缓解压力、降血糖和降血脂等作用。因此，近年来抹茶在全世界范围内受欢迎的程度和关注度不断上升。

抹茶作为天然食品添加剂广泛应用于冰淇淋、奶茶、面条、饼干和蛋糕等高端食品加工[8-10]，其直接饮品在中国的消费量也逐年增加。与茶叶多次冲泡取茶汤饮用方式不同，抹茶通常用水冲泡之后形成茶汤和茶粉整体摄入，实现了从“饮茶”到“吃茶”的转变。一般认为，抹茶的这种摄入方式可最大化地利用茶叶中的营养物质，包括膳食纤维等大分子和与之结合的多酚等小分子物质，但有关抹茶粉各类物质在加工及摄入后的消化过程中变化研究甚少。就茶多酚而言，研究[11]表明不同茶叶成品形态及冲泡条件对其生物可及性以及生物利用度有重要的影响，如相同冲泡条件下袋泡茶比散茶叶的茶多酚更易溶出，从而具有更高的生物可及性。但抹茶作为粒径为10～32 μm的超微茶粉，其茶多酚的溶出情况和抗氧化活性等尚未明确。

试验拟通过分析抹茶汤pH值、可滴定酸、色差、VC等理化指标及感官品质，利用UPLC分析多酚组成和含量及抗氧化活性，为抹茶营养功能的全面认知和深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

抹茶：宇治抹茶(YZM)、曹老爷抹茶(CLM)均购于陕西西安华润万家超市，置于密闭容器中并于4 ℃避光保存备用；

没食子酸(GA)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、咖啡因(CAF)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)标准品：纯度为98%，美国Sigma-Aldrich公司；

无水乙醇、碳酸钠、氢氧化钠、过硫酸钾、氯化铁：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

福林酚试剂：分析纯，西安晶博生物科技有限公司；

2,2-二苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-连氮双-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸 (ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)-s-三嗪(TPTZ)、VE(Trolox)：纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅：HH-S6A型，北京科伟永兴仪器有限公司；

高速离心机：HC-3018型，安徽中科中佳科学仪器有限公司；

酸度计：PB-10型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

色彩色差计：CM-350D型,日本Mionha公司；

酶标仪：Multiskan GO型，美国热电(西安)公司；

真空冷冻干燥机：LGJ-18C型，北京四环科学仪器厂；

高效液相色谱仪：U-3000型，美国Thermo Fisher公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 根据文献[12]，修改如下，称取宇治抹茶及曹老爷抹茶各1.0 g与100 mL、80 ℃蒸馏水混合，水浴保温30 min后离心、收集上清液定容至100 mL。与一泡方法相同，茶渣用80 ℃蒸馏水重复浸提两次，从而得到二泡、三泡茶汤，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 理化指标测定

(1) pH值：酸度计测定。

(2) 可滴定酸：氢氧化钠滴定法[13]。

(3) 色差：色差仪测定。

(4) VC：碘量法[14]。

1.3.3 感官评分 由10名感官品评员组成评价小组，对上述冲泡的抹茶汤进行感官质量评定。品评员培训及实验室要求参照GB/T 16291.1—2012和GB/T 13868—2009相关要求，抹茶感官审评方法参照GB/T 23776—2018并稍作修改。评定项目包括汤色、香气和滋味，满分100分，取10人评分的平均值作为评分结果，评分标准见表1。

表1 抹茶汤的感官评分标准

1.3.4 总多酚含量测定 根据文献[15]，略作修改。吸取50 μL茶汤与50 μL福林酚试剂混合、摇匀，然后再加入800 μL 蒸馏水，充分摇匀，室温下静置8 min后加入7.5% Na2CO3溶液800 μL，摇匀后于室温下避光放置1 h，然后在765 nm下测其吸光度A，以没食子酸制作标准曲线并计算样品茶多酚的含量。总多酚含量表示为毫克没食子酸当量每克干重，即mg GAE/g ·DW。

1.3.5 UPLC分析 色谱柱：C18柱，150 mm×3 mm，3 μm；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：100%甲醇；洗脱程序：0～2 min，18% B；2～5 min，18%～34% B；5～8 min，34%～35% B；8～16 min，35%～38% B；16～17 min，38%～60% B；17～22 min，60% B；22～24 min，60%～18% B；24～26 min，18% B。流动相流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，柱温30 ℃。

1.3.6 抗氧化活性

(1) 清除DPPH自由基能力：参照Celep等[16]的方法，略作修改。准确吸取500 μL浓度为2×10-4mol/L的DPPH工作液与100 μL待测茶汤样品溶液混合摇匀，室温下避光反应30 min，于517 nm下测定混合反应液吸光度A1。样品对照组用无水乙醇代替DPPH工作液测定其吸光度A2；空白组用无水乙醇代替样品液测定吸光度A0，按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

A1——样品吸光度值；

A2——样品对照吸光度值；

A0——空白对照吸光度值。

以不同摩尔浓度(2.0×10-5～2.0×10-4mol/L)的Trolox清除DPPH自由基的能力作标准曲线，以清除率为纵坐标，Trolox摩尔浓度为横坐标。根据回归方程计算待测茶汤样品的Trolox当量抗氧化能力，结果表示为微摩尔Trolox当量每克干重，即μmol TE/g ·DW。

(2) 清除ABTS+自由基能力：根据刘薇等[17]的方法，略作修改。取7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液各5 mL，混合均匀，于避光处放置24 h。使用前用无水乙醇稀释使A734为(0.70±0.20)即可。然后准确吸取750 μL ABTS工作液与100 μL待测茶汤样品溶液混合摇匀，室温下避光反应6 min后，于734 nm处测其吸光度A1，同时用无水乙醇代替样品液作为对照测定其吸光度A0，按式(2)计算ABTS+自由基清除率。

(2)

式中：

K——ABTS+自由基清除率，%；

A1——样品吸光度值；

A0——空白对照吸光度值。

以不同摩尔浓度(4.0×10-5～1.6×10-4mol/L)的Trolox清除自由基的能力作标准曲线，以清除率为纵坐标，Trolox摩尔浓度为横坐标。根据回归方程计算待测茶汤样品的Trolox当量抗氧化能力，结果表示为微摩尔Trolox当量每克干重，即μmol TE/g·DW。

(3) FRAP法测定总抗氧化能力：参考Zhou等[15]等的方法配制FRAP工作液，将pH 3.6醋酸缓冲液、20 mmol/L FeCl3·6H2O和10 mmol/L TPTZ溶液按比例(10∶1∶1)均匀混合。取900 μL FRAP工作液与100 μL一系列FeSO4·7H2O标准溶液(1.0×10-4～6.0×10-4mol/L)或者样品液混合，摇匀，37 ℃下孵育30 min后，于593 nm下测定吸光度A，结果表示为微摩尔FeSO4当量每克干重，即μmol FE/g·DW。

1.4 统计分析

所有试验重复3次，结果表示为(平均值±标准偏差)。使用SPSS软件进行分析其差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 抹茶汤pH、可滴定酸、色差和VC的测定

由表2可知：

(1) 两种市售抹茶汤的pH值在(5.98±0.01)～(6.43±0.02)，与已报道[18]绿茶茶汤的pH值一致。同时随着冲泡次数的增加，pH值略有升高，可能与冲泡过程中茶碱逐渐溶出和可滴定酸的含量逐次降低有关[19]。

(2) 随着冲泡次数的增加，L值逐渐增加，一泡茶汤的明亮度显著低于二泡、三泡茶汤，二泡和三泡茶汤的明亮度无显著差异，可能是一泡茶汤水浸出物的茶多酚氧化产物迅速浸出，增加了茶汤的浊度，但随着冲泡次数的增加，茶汤内含物减少，明亮度增强。a值无显著变化，b值逐渐降低，即黄度逐渐减弱，说明茶汤中呈现黄色的儿茶素和黄酮类物质随着冲泡次数增加溶出减少[20]。

(3) YZM和CLM两种抹茶的一泡茶VC含量分别为(10.45±0.95)，(13.3±0.95) mg/100 mL，而二泡、三泡的茶汤中未检测到VC。

2.2 抹茶汤品质感官审评结果分析

由表3可知，3次冲泡抹茶汤的审评总评分在72.8～95.2，两种抹茶一泡茶汤感官评分得分最高，均在90分以上，其茶汤色彩鲜艳，香气呈现为嫩香型，滋味醇厚甘爽，易被审评人员接受。随着冲泡次数的增加，茶汤感官评分逐渐降低，色泽、香气和滋味相应地变差。三泡茶汤评分最低，具体表现在色泽较差、香气老火、滋味浓涩和有颗粒感。

2.3 抹茶汤总多酚含量

由图1可知，不同冲泡次数的茶汤多酚存在显著差异(P<0.05)，一泡茶汤的多酚含量最高，随着冲泡次数的增加，茶多酚含量急剧减少，二泡茶汤中茶多酚含量几乎为一泡的1/2。说明茶多酚随冲泡次数增加而溶出减少，与魏雪等[21]的结果一致。从释放的总多酚来看，YZM和CLM两种抹茶汤含量无显著差异，分别为(203.48±5.91)，(210.38±1.49) mg GAE/g·DW，与Tontul等[22]对土耳其绿茶粉总多酚的报道(214.9～232.4 mg GAE/g·DW)一致。实际饮用过程中抹茶通常通过1次冲泡后茶汤和茶粉整体摄入，而试验发现1次冲泡多酚含量约占3次冲泡抹茶茶汤总多酚含量的66%。说明有相当比例的茶多酚仍存在于抹茶粉中，可能与茶粉基质中难溶的多糖和蛋白质等大分子一同进入机体，其在消化过程中的释放情况有待进一步研究。

表2 冲泡次数对抹茶汤pH、色差、可滴定酸和VC的影响†

† YZM-1表示一泡，YZM-2表示二泡，以此类推；同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表3 冲泡次数对抹茶汤感官品质的影响†

† YZM-1表示一泡，YZM-2表示二泡，以此类推。

2.4 抹茶汤多酚化学组成

由图2可知，两种抹茶汤的化学轮廓相似，8种儿茶素成分和咖啡因均有检出。总体上看，CAF、EGCG、EGC、EC和ECG为茶汤中含量相对较高的5种化合物。其中YZM和CLM两种抹茶茶汤3次提取的EGCG总含量分别为(14.84±0.61)，(30.44±1.24) mg/g·DW，与Weiss等[3]结果相比，其EGCG含量比绿茶含量[(0.42±0.05) mg/g·DW]高，但比甲醇提取的抹茶汤含量(57.4 mg/g·DW)低，可能与所用提取溶剂等条件不同有关。此外，抹茶茶汤中CAF含量也比一般绿茶含量高[2]，而GA、GC、C和GCG含量相对较少，其范围在1～3 mg/g·DW。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

由图2还可知，9种有效物质的含量在3次冲泡茶汤中逐次降低。林春芳等[20]进行了白茶中酚类成分的提取动力学分析，结果显示在某一特定温度下，提取时间对酚类成分的释放有显著影响，各物质的提取速率在前50 min明显较快。而试验中，3次冲泡茶汤各物质差异较大。以CLM为例，一泡30 min冲泡茶汤中，9种有效成分全部检出，其含量顺序为：CAF>EGCG>EGC>EC>ECG>GC>GCG>GA>C，其中CAF含量高达(28.34±1.03) mg/g·DW；二泡茶汤中9种有效成分虽均被检测到，但各物质的含量显著低于一泡茶汤(P<0.05)，其中GC含量由(2.40±0.10) mg/g· DW减至(0.17±0.02) mg/g·DW，EGC含量由(19.61±1.05) mg/g·DW减至(1.11±0.02) mg/g·DW，C含量则由(1.17±0.05) mg/g·DW 锐减至(0.15±0.02) mg/g·DW；随后在三泡茶汤中，GC、EGC和C均未检出，其他物质含量也低于二泡茶汤。YZM和CLM两种抹茶茶汤3次冲泡释放总酚类化合物含量分别为68.10，106.60 mg/g·DW，稍低于Yang等[23]报道的不同粒径范围绿茶粉的总儿茶素含量[(156.39±2.90)～(162.57±1.17) mg/g·DW]，而高于Zaiter等[24]报道的绿茶粉的总儿茶素含量(20.0～33.5 mg/g·DW)，可能与不同研究中所采用的方法和原料差异有关。

1. YZM 2. CLM

2.5 抹茶汤抗氧化活性测定

以YZM和CLM两种抹茶的3次冲泡茶汤为样品，分别测定DPPH自由基、ABTS+自由基的清除效果和FRAP法测定总抗氧化能力，综合评价体外抗氧化活性，结果如图3所示。

由图3(a)可知，YZM和CLM两种抹茶一泡茶汤对DPPH自由基清除能力较高，分别为(915.65±11.03)，(1 128.45±115.96) μmol TE/g·DW，说明抹茶茶汤多酚对DPPH自由基有较强的清除能力。与韩卫娟等[25]对柿叶茶、杜仲雄花茶、绿茶和红茶体外抗氧化活性研究结果相比，一泡抹茶茶汤的DPPH自由基清除能力比上述4种茶的能力都强。但随着冲泡次数的增加，二泡茶汤的DPPH自由基清除能力分别减少了762.40，964.93 μmol TE/g·DW，三泡茶汤的DPPH自由基清除能力为二泡茶汤的1/2，与多酚含量变化趋势一致。由图3(b)可知，3次冲泡茶汤对ABTS+自由基也具有清除活性，且三者之间均存在显著差异。一泡茶汤的ABTS+自由基清除能力仍最强[分别为(680.23±57.82)，(779.82±121.51) μmol TE/g·DW]，为二泡茶汤的8倍，三泡茶汤的20倍。由图3(c)可知，FRAP法测得抗氧化活性大小为一泡>二泡>三泡，该结果与上述DPPH和ABTS+自由基清除能力一致。总体而言，抹茶汤具有较高的体外抗氧化活性，多酚含量与其抗氧化能力存在明显的正相关。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

3 结论

试验系统分析了宇治抹茶和曹老爷抹茶3次冲泡抹茶茶汤的pH、可滴定酸、色差、VC、总酚、儿茶素、咖啡因的含量及其抗氧化能力，并进行感官审评。结果表明，两种抹茶间品质差异不显著，其活性成分均随冲泡过程逐渐地溶出，3次冲泡茶汤间存在明显差异。其中，一泡茶汤的色香味感官品质最优，总多酚和儿茶素等单体的含量也最高，其主要组分为表没食子儿茶素没食子酸酯、咖啡因和表没食子儿茶素；同时表现出明显的DPPH、ABTS+自由基清除活性和总抗氧化能力。然而，实际饮用中抹茶通常是1次冲泡整体摄入，研究表明1次冲泡茶汤中的多酚含量仅占3次冲泡抹茶茶汤总多酚含量的66%，说明实际饮用中抹茶粉中仍有相当比例的茶多酚未能溶入茶汤，可能与茶粉基质中难溶的多糖和蛋白质等大分子一同进入机体，其在消化过程中的释放情况有待深入研究。