gvpA-C间隔区在微囊藻株系分型中的应用

李小栋 王雅丽 高 宏 徐旭东 孔任秋

(1. 中国科学院水生生物研究所，武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

蓝藻水华的发生, 不仅影响了水生态系统, 也严重影响了人类的健康。微囊藻是最常见的水华蓝藻类群之一, 分布广泛, 暴发持续时间长, 一些种类产生的微囊藻毒素引起了许多生态环境和人类健康问题。研究不同类型微囊藻种群间的竞争及演化规律对于揭示微囊藻水华发生机理有重要意义。由于16S rDNA序列的保守性, 应用16S rDNA作为分子指标已经成为原核生物检测与分类鉴定的重要工具[1]。通过分子生物学手段对16S rDNA序列进行分析, 虽然在一定程度上揭示了微囊藻与蓝藻其他属的差异, 但也难以区分微囊藻不同种类、株系, 曾报道根据形态分类的5种微囊藻在16S rDNA序列水平上只能分为一类[2,3]。不同的地理株之间16S rDNA序列也显示高度相似[4]。16S-23S rRNA ITS序列和多位点管家基因序列类型可以从生态学角度揭示微囊藻种间或种内的多样性[5—7], 但是需要有更多显示遗传多样性的株系分型方法。

微囊藻具有能调节浮力的气囊结构, 气囊聚集形成光镜下可见的伪空胞, 减少细胞比重, 使其漂浮到水面, 获得光照和CO2。气囊是两头尖的中空柱状结构, 由GvpA单层蛋白组成, GvpC起加固作用[8]。Xu等[9]报道了微囊藻FACHB854、910、916、927、929、930等藻株中完整gvp基因丛结构, 发现gvpA-gvpC区域存在4种结构类型,gvpA和gvpC基因本身较为保守, 而gvpA-C基因间隔区序列具有较高的变异性, 其序列类型可以作为区分微囊藻株不同类型的依据。本文从暴发蓝藻水华的水体中分离蓝藻藻株, 对其中38株微囊藻分别进行了gvpA-C间隔区序列和16S rDNA序列分析,进一步证明gvpA-C间隔区序列对于微囊藻株系分型的实用价值。

1 材料与方法

1.1 藻样的采集与分离

在湖北省大冶市保安湖东北岸扁担塘湖区一处人工水塘中, 分别于2016年和2017年蓝藻水华暴发期间, 用网目尺寸为64 μm的25#浮游植物网采集水华藻样。采集的藻样先在显微镜下计数, 计算样品中的藻细胞密度, 稀释至2.5 个cells/mL, 在无菌的96孔板中每孔加入200 μL 用BG11[10]培养液稀释后的样品。待长出浅绿色后, 转接至试管中扩大培养。在光学显微镜下初步鉴定藻种。

1.2 微囊藻gvpA-C间隔区和16S rDNA测序

分离的藻株用BG11培养, 至对数期时分别提取基因组DNA。以基因组DNA为模板, 以gvpAC-1和gvpAC-2为引物[9]进行PCR, 扩增微囊藻gvpAC间隔区序列(gvpAC-IGS)。DNA提取和PCR反应条件参照文献[9]进行。PCR产物经电泳检测后送武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。

在扩增微囊藻16S rDNA序列时, 先以蓝藻特异的引物CYA108F/CYA16CYR[11]进行第一轮PCR(反应条件同上), 扩增蓝藻16S rDNA片段, 并以此片段为模板, 以MIC16SF/MIC16SR(本研究设计)和CYA108F/MIC16SR为引物分别进行第二轮PCR,并将PCR产物送测序。引物及序列如表 1所示。

表 1 本文中使用的引物及其序列Tab. 1 Primers used in this study

1.3 序列比对和系统进化树构建

用mafft和Clustal X对测序所得序列进行比对,分别根据微囊藻gvpA-C间隔区序列和16S rDNA序列对微囊藻进行分类。使用mafft和MUSCLE对不同gvpA-C间隔区类型序列进行比对[12], 结合文献[9]中的8株微囊藻(CHAO、TAI、FACHB854、910、916、927、929和930, 其对应的GenBank登录号分别为DQ889221、EF035170、AY254709、DQ8888 06、DQ888807、DQ888808、DQ888809和DQ 888810）的gvpA-C间隔区序列, 使用最大似然法(ML), 通过MEGA6.0构建系统进化树[13]。

2 结果

2.1 藻株分离纯化

在野外收集到的藻细胞样品, 在显微镜下计数、初步计算藻细胞密度, 然后在灭菌的试管中用BG11进行梯度稀释至约2.5 cells/mL, 加至96孔板中, 每孔0.2 mL, 即每孔平均约有0.5个藻细胞。将96孔板置于30℃、30 μE/(m2·s)条件下静置培养。约1周后, 部分孔中培养液变绿, 将变绿的培养液接入试管继续培养。取少量藻细胞在光学显微镜下观察, 发现有些是单细胞藻株。各藻株在实验室培养条件下呈分散状态, 细胞呈球形或椭球形, 大小略有差别。图 1为部分单细胞蓝藻显微照片。

2.2 PCR扩增确认微囊藻

用引物gvpAC-1/2从47个藻株扩增出gvpA-C基因间隔区片段, 观察到有2种类型的条带, 一种约为0.5 kb, 另一种约为0.7 kb (图 2A)。尝试用文献中报道的微囊藻特异引物[14]扩增这47株藻的16S rDNA, 结果未获得条带。之后, 采用两步扩增的方法, 即先用蓝藻特异的16S rDNA引物CYA108F/CYA16CYR进行第一轮扩增, 获得约1.2 kb的片段(图 2B), 然后以此PCR产物为模板, 以MIC16SF/MIC16SR为引物进行第二轮扩增, 在38个藻株获得条带, 大小约为0.53 kb (图 2C)。将第二步PCR产物送测序, 将所获得的16S rDNA序列在NCBI网站比对, 确认这38株藻均为微囊藻。

2.3 序列分析

图 1 部分单细胞蓝藻藻株光镜照片Fig. 1 Light microscope images of unicellular cyanobacterial strains

gvpA-C间隔区序列 由电泳结果可以看出,扩增出的gvpA-C基因间隔区片段有2种条带, 测序后得到相应序列。取gvpA基因终止密码子与gvpC基因起始密码子之间的序列用于比较分析。gvpA-C基因间隔区序列大小有267、441、442和445 bp 四种长度, 其中后3种较长的序列与267 bp的序列相差172—176 bp, 多出的即为gvpA-C基因间隔区中的额外序列[9]。对38株藻的gvpA-C间隔区序列进行比对, 发现可分为11个类型, 其序列及比对结果如图 3所示。序列类型1—3不含额外序列, 类型4—11中间第128—306位碱基之间含有额外序列。有18株藻的gvpA-C间隔区序列大小为267 bp,7株藻的序列为445 bp, 11株藻的序列为441 bp, 2株藻的序列为442 bp。去掉额外序列, 各类型之间具有89%—99%的相似度。

图 2 PCR产物电泳检测Fig. 2 Electrophoreses of PCR products

图 3 微囊藻11个类型gvpA-C基因间隔区序列比对Fig. 3 Alignment of 11 types of gvpA-C intergenic sequences of Microcystis

16S rDNA序列分析 以MIC16SF/MIC16SR为引物进行第二轮扩增成功率高, 适合于藻株的鉴定, 但是获得的0.53 kb的16S rDNA序列仅有3种类型, 各类型之间有一个碱基的差别。通过分析比对已发表的29个微囊藻16S rDNA序列[2,3], 其相似性＞99%, 针对变异较多的区域, 我们又进一步以引物CYA108F/ MIC16SR成功扩增出了其中22株微囊藻的16S rDNA约0.69 kb的序列。比对显示, 这22株微囊藻16S rDNA序列可以分为7个类型, 不同类型之间有差异的碱基位点共有8个, 类型之间序列相似性＞99% (图 4)。

两种分型的交叉关系 以两种分型方法对以上22个藻株进行分型(表 2), 显示其交叉关系。16S rDNA序列分型主要分布在gvpA-C间隔区类型1、4、5、6、7、8、9、10等8个类型, 其中16S rDNA类型5所有藻株与gvpA-C间隔区类型1是交叉的, 而后者是不具有额外序列的间隔区序列类型;其余类型多株藻分别归属于不同的gvpA-C间隔区类型, 如16S rDNA序列类型3与gvpA-C间隔区类型4、7和8交叉, 类型6与gvpA-C间隔区类型1、9和10交叉。gvpA-C间隔区类型2、3、11藻株未成功获得0.69 kb的16S rDNA序列。

2.4 微囊藻gvpA-C间隔区的系统进化树

将上述11种gvpA-C间隔区类型的微囊藻和本实验室以前曾分析过的8株微囊藻(FACHB854、910、916、927、929、930、CHAO、TAI)的gvpAC间隔区序列[9]共同构建系统进化树(ML, 图 5)。使用不同比对方法进一步构建的系统进化树相一致。结果显示, 含有和不含有额外序列的类型分别聚成一簇, 与以前的结论相一致。

3 讨论

研究水华蓝藻优势种和不同类型的演替, 需要有效、快捷的藻株分离和鉴定方法。尤其是微囊藻这类形成群体的蓝藻, 如何尽可能分离到水体中不同类型的藻株, 并且有效地鉴定、区分, 存在一定技术难度。

从自然水体中分离微囊藻的常见方法有平板划线法[15]以及用微细玻璃管直接吸取单细胞的方法[16]。本研究曾尝试用这两种方法分离微囊藻, 但采用平板法时基本未能长出微囊藻单藻落, 而用微细玻璃管在显微镜下直接吸取单个藻细胞操作难度也较大。之后, 我们用96孔板结合极限稀释法,较为便捷地获得了微囊藻单种藻株, 筛选时间较短、效率较高。

微囊藻传统的分类法是根据细胞和群体形态,据报道曾经有50多种微囊藻被描述记载。同一微囊藻种的生态表型存在多样性, 而不同的微囊藻有时又有着相同的生态表型和过渡类型, 室内培养和野外群体也存在较大差别。虞功亮等[17]根据形态分类方法, 将中国的微囊藻属26个种归纳为10个种。也有分析认为微囊藻属的形态分类是无效的[2],需要进一步结合基因序列特征对微囊藻进行分型,研究其种群变动。以16S rDNA作为蓝藻分类鉴定的依据可以将微囊藻与其他蓝藻区分开来。但是,本研究以前人报道的微囊藻特异引物并未能直接扩增出16S rDNA序列片段。改用细菌通用引物又不能回避微囊藻所黏附的细菌的干扰。为此, 本研究采用两步扩增的方法, 即先用蓝藻特异引物扩增,产物为蓝藻的16S rDNA片段, 然后以此产物为模板, 再用细菌通用引物扩增、测序, 即可鉴定是否为微囊藻16S rDNA序列, 但是如果扩增全长序列还需要两步以上PCR才能得到[2]。与16S rDNA片段的扩增相比,gvpA-C基因间隔区的扩增更加方便。以gvpA基因3′端和gvpC基因5′端的保守序列设计引物, 即使在有杂菌的情况下, 亦可一步扩增出gvpA-C间隔区片段, 没有杂带干扰, 产物直接测序便可得到目的序列。

图 4 微囊藻7个类型16S rDNA序列比对Fig. 4 Alignment of 7 types of 16S rDNA sequences of Microcystis

表 2 依据gvpA-C间隔区与16S rDNA两种序列对微囊藻株系的分型Tab. 2 Categories of Microcystis strains on the basis of gvpA-C IGS and 16S rDNA sequences

图 5 微囊藻gvpA-C间隔区序列的最大似然系统进化树Fig. 5 Maximum likelihood phylogenetic tree of gvpA-C intergenic sequences of Microcystis

对微囊藻不同株系16S rDNA序列的比较显示其差异微小、多样性较低[2]。在本研究中, 22株微囊藻的16S rDNA序列可以分为7种类型, 相互有差异的碱基位点共有8个, 与已发表的29个微囊藻16S rDNA序列显示出的多样性程度相似[2,3], 比对相似性＞99%。与此不同,gvpA-gvpC间隔区以较短的序列却显示出更高的多样性。Xu等[9]发现, 微囊藻gvpA-gvpC区域的结构和序列变化较大, 认为在微囊藻生态学和生物地理学研究方面或可作为区分不同藻株的依据。在本研究中, 微囊藻gvpA-C间隔区序列在去掉额外序列后相似度在89%—99%, 相互有差异的碱基位点共有50余个, 在系统进化树中可以显著地分型、聚类; 有的具有172—176 bp的额外序列, 进一步增加了多样性。在依据16S rDNA的分型和依据gvpA-gvpC间隔区的分型之间存在交叉, 很可能是由于不同株系间存在横向转移导致的。

在以往的研究中,cpcBAIGS[18]和16S-23S ITS[19,20]等位点的基因序列分析都曾较成功地应用于微囊藻分型。本实验室的研究显示,gvpA-C间隔区的多样性和类型间差异丰富, 也不失为一种良好的分型新位点, 并且其PCR扩增过程较为简便, 具有应用价值。