基于VEGF/FGF血管生成因子及TNF因子表达研究鹤草茶束胎的功效与机制

冯翮飞,郭 涛,黄 敏,苏 旺,夏得月,杜青青,杨 帆,刘佳敏,张晓宇,孙 杰,吴艺舟

(1.南京医科大学 护理学院,江苏 南京211166；2.南京医科大学第一临床医学院,江苏 南京211166；3.南京医科大学 口腔医学院,江苏 南京211166；4.南京医科大学 儿科学院,江苏 南京211166；5.南京医科大学 公共卫生学院,江苏 南京211166；6.南京医科大学 基础医学院,江苏 南京211166)

仙鹤草(Agrimonia pilosaLedeb.)属蔷薇科植物,别名龙牙草、脱力草、瓜香菜,是我国滇南地区的常食野菜,也是深受美国和加拿大等国家欢迎的花草茶。仙鹤草全草含有三萜皂甙与类黄酮[1],乌索酸、果胶酸、均苯三甲酸、科罗索酸等植物多酚与有机酸[2,3],仙鹤草素等活性成分,以及少量鞣质、挥发油、维生素和人体必需微量元素[4]。仙鹤草的干燥地上部分是我国一味传统草药,性苦、涩,味平,归心、肝经,具有收敛止血、截疟止痢、解毒补虚的疗效,可用于咯血、吐血、崩漏下血、疟疾、血痢、痈肿疮毒、阴痒带下、脱力劳伤的治疗(参见《中国药典(2015版)》)。当代研究发现,仙鹤草提取物对氧化应激损伤具有很好的保护作用,具有抗氧化和醛糖还原酶抑制活性[5-7],是很好的天然抗氧化剂及功能性食品开发资源[8]。也有研究证实,仙鹤草不同提取物在动物试验中呈现良好的收敛止血、抗菌以及镇痛作用[9-11],其作用机制与清除自由基有关[11,12]。

随着我国物质生活水平的提高,我国巨大儿发生率呈不断上升趋势。根据2006年的统计数据显示,我国东、中、西部巨大儿发生率分别为8.2%、5.9%、5.2%,分娩巨大儿对母婴均有危害,孕妇产前肥胖、糖尿病史、过期妊娠、高龄产妇等均为巨大儿发生的高危因素[13]。巨大儿的发生与营养、遗传、心理因素均有关,因此单纯控制孕妇饮食,并不能绝对避免巨大儿的发生。目前,如何降低巨大儿发生率已成为亟待解决的妇产科难题。中医自古既有束胎的治疗方案,《金匮钩玄》《女科指掌》《本草纲目》等中医古籍中均有束胎、缩胎易产的记载。本课题组在前期研究发现,仙鹤草的提取物在动物实验中呈现束胎功效,且无明显毒副作用,其发挥束胎功效的机制尚不明确。

一般来说,对血管生长具有调节作用的化合物多可影响动物胚胎血管的新生过程。青蒿等与仙鹤草具有相似抗疟活性的中草药,其所含多个天然药物成分均具有调控啮齿类胚胎血管新生进而影响胚胎发育的作用[14,15]。仙鹤草具有止血止泻的功效,提示其束胎功效可能与调控胚胎血管及机体炎症发生的过程有关。本次试验以ICR孕鼠为模型,研究鹤草茶的束胎功效,以及其束胎过程中对鼠胚组织中血管表皮生长因子(VEGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、雌激素受体(ER)表达的影响,初步揭示仙鹤草束胎作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 鹤草茶制备

用于本研究的仙鹤草由南京同仁堂药业有限责任公司提供。将仙鹤草分别以60、80、100mg/mL浸没于沸腾蒸馏水,维持溶液沸腾状态5 min,封闭容器至室温,浸提5h,过滤除去残渣,所得浸提液作为供试溶液。

1.2 抗体与试剂

Rabbit Anti-FGF1和Rabbit Anti-TNF-α抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,孵育浓度1∶300；Rabbit Anti-VEGF抗体购自武汉博士德生物工程有限公司,孵育浓度1∶50,一抗－40℃保存。即用型SABC-AP(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,4℃保存,操作方法参见产品说明书。Poly-L-Lysine(Sigma)处理载玻片、0.01 mol/mL PBS(pH7.2～7.4)缓冲液配置、0.01mol/mL枸橼酸盐缓冲液的配制参照常规。

1.3 实验动物

8周龄ICR小鼠购自南京医科大学实验动物中心,实验动物生产许可证号为SCXK(苏)2016-0002。体重范围雌鼠21～23g,雄鼠23～25g。实验动物饲养于温度20～26℃、相对湿度40%～70%的屏障环境中,实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2015-0009。辐照灭菌饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供,生产许可证：苏饲证(2014)01008。实验动物检疫合格后,每天检查雌鼠发情期状态,将发情期雌鼠与雄鼠1∶1交配过夜,次日清晨检查精栓并分笼,发现精栓的当天记为受孕0.5 dpc(days postcoitum)。

1.4 束胎实验

ICR孕鼠40只,随机分为高、中、低鹤草茶组与对照组,共4组。鹤草茶组孕鼠自受孕8.5dpc起,分别以每日新鲜制备的60、80、100 mg/mL鹤草茶替代饮用水,试验期间孕鼠自由摄食摄水,每日观察体征与死亡情况,记录各组饮水量。同期摄入蒸馏水孕鼠为空白对照组。胎仔出生当天记作1.0 dpp(days postpartum),记录并比较各组孕鼠的平均产仔时间、平均产仔数、平均仔重、仔鼠存活率、21 dpp平均断乳体重以及断乳存活率。

1.5 中期样本的采集

各组孕鼠于13.5dpc时随机处死一半,迅速进行大体解剖观察并统计各组活胎、死胎与吸收胎数量。剥离的完整鼠胚,使用0.01 mol/mL PBS配制的4%多聚甲醛固定1 h,经(30±1)%～(98±1)%乙醇梯度脱水后,二甲苯透明两次,包埋于58℃低熔点石蜡中。使用LEICA RM2235石蜡切片机制备7μm组织切片,4℃保存。

1.6 免疫组织化学

组织切片于60℃下烘烤2 h,经二甲苯浸透除蜡,(98±1)%～(30±1)%乙醇梯度复水各15 min,枸杞酸盐缓冲液100℃抗原修复10min,一抗37℃孵育1.5 h,二抗37℃孵育30 min,BCIP/NBT显色20min,核固红染料轻度复染0.5min。

组织图像使用Image-Pro Plus 6.0软件学分析。每个胚胎取4张组织切片检测,选择阳性显色点,分别统计鼠胚脑、内脏、脊椎部位整视野下切片的平均显色点面积(area)、平均光密度(density)和累计光密度值 (integrated optical density,IOD)。

1.7 统计数据分析

2 结果与分析

2.1 鹤草茶摄入量

摄入60～100mg/mL仙鹤草制备的浸提物后,各组孕鼠未见明显异常体征,100 mg/mL鹤草茶组部分孕鼠于妊娠后期出现缓动、嗜睡症状。鹤草茶摄入曲线(图1A)结果显示,各浓度鹤草茶组孕鼠在8.5～9.5 dpc时段内的平均水分摄入量均高于空白对照组(＝5.00 mL/d),80 mg/mL组与100mg/mL组孕鼠在摄入鹤草茶24h内出现水分摄入高峰(＝11.25 mL/d)；24 h之后60mg/mL组与80 mg/mL组的日均水分摄入量高于空白对照组,100 mg/mL组(＝3.75 mL/d)低于空白对照组,而60 mg/mL组的鹤草茶日均摄入量与空白对照组相比,差异较小。

8.5～1 9.0dpc时段的鹤草茶的日均摄入量(图1B)结果显示,各浓度鹤草茶组孕鼠与对照组孕鼠相比,虽总水分摄入量略高,但无统计学差异(P＞0.05)。根据各组孕鼠实际日均摄入量换算,则60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL鹤草茶组孕鼠每日实际鹤草茶摄入量分别为(348±46.2)mg、(572.8±200.8)mg、(632±359)mg(以制备浸提液的仙鹤草干重计)。

2.2 胚胎发育

各试验组一半孕鼠于13.5dpc时使用CO2处死,各试验组孕鼠大体解剖观察均未见明显脏器病变或异常,胚胎发育指标见表1。鹤草茶各剂量组孕鼠与对照组孕鼠相比,平均胎数未见显著差异(P＞0.05),且在妊娠期间均未发生死胎、吸收胎及发育异常。

Tab 1. Embryonic development index

Fig 1. Analysis on intake of Crane Tea

2.3 胎仔发育指标

在8.0～18.0 dpc致畸敏感期内给予孕鼠60～100mg/mL仙鹤草制备的浸提物,与对照组相比,未对孕鼠产仔时间产生显著影响,各组别孕鼠产仔时间均为18.5～19.0 dpc。各试验组间平均胎仔数指标无统计学差异(P＞0.1),60～100 mg/mL鹤草茶组胎仔的平均体重指标均低于对照组,80mg/mL鹤草茶组与100mg/mL鹤草茶组胎仔平均体重的降低与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),60～100 mg/mL鹤草茶对胎仔存活率无影响,各鹤草茶组胎仔均未见异常体征(表2)。

Tab 2.1 dpp Fetal development index

21 dpp胎仔离乳时(表3),60～100mg/mL鹤草茶组胎仔的平均离乳体重均低于对照组(P＜0.01),且呈剂量效应。60 mg/mL鹤草茶组胎仔围产期存活率未受影响,而80～100mg/mL鹤草茶组胎仔在21 dpp哺乳期间存活率下降,其中,100 mg/mL鹤草茶组胎仔与对照组相比存活率降低了11.4%。

Tab 3.21 dpp Fetal development index

2.4 胚胎中细胞因子的表达

实验动物围产期数据显示,给予孕鼠60～80 mg/mL鹤草茶具有明确的束胎功效,且未见显著毒性作用。进一步采用石蜡切片免疫组化方法,对80 mg/mL鹤草茶组胚胎进行VEGF、FGF、TNF、ER表达水平检测,图片数据使用Image-Pro Plus 6.0程序intensity光密度反向条件下,选择阳性显色点区域,统计×64显微视野下平均显色点直径Area(mean),组间各细胞因子的免疫显色识别区平均面积(Area)无统计学差异。

各细胞因子免疫组化结果显示,80 mg/mL鹤草茶组小鼠胚胎中的VEGF(P＜0.01)、FGF(P＜0.05)和TNF(P＞0.05)的平均表达水平均高于对照组(图2 A-C),但ER表达水平未见显著影响(P＞0.05)。

Fig 2. Cytokine expression in embryos

3 结论

本研究结果证实鹤草茶具有束胎功效,以60～100 mg/mL仙鹤草制备的浸提物均可减低胎仔出生时的平均体重,其中,80～100mg/mL鹤草茶组胎仔平均体重与对照组相比,有统计学差异(P＜0.05)。100 mg/mL鹤草茶组孕鼠于妊娠后期出现缓动、嗜睡症状,虽该组别仔鼠21 dpp离乳存活率下降明显,但在孕中期解剖过程中未见死胎与吸收胎,部分体重较轻仔鼠于哺乳期间死亡,此结果可能与体重较轻仔鼠难以争得足够乳汁有关。因此,60～80 mg/mL仙鹤草制备的浸提物为相对安全的动物束胎试验剂量浓度。

以80 mg/mL鹤草茶组孕中期胚胎制作石蜡切片,对抗炎与调控血管新生相关细胞因子进行免疫组化分析,结果显示,孕鼠摄入80 mg/mL仙鹤草制备的浸提物后,胚胎中VEGF(P＜0.01)及FGF(P＜0.05)表达水平与对照组相比显著升高。VEGF是机体创伤后自愈修复的关键因子,具有促进新生血管表皮细胞生长、增加血管通透性等作用。外源性NO诱导、内皮细胞和iNOS的过度表达均可增加特定病理组织中的VEGF浓度[16]。VEGF在经信号分子激活后,与三种VEGFR结合,激活VEGFR的酪氨磷酸化位点,启动信号级联效应[17]。FGF是组织再生的标志性细胞因子,具有广泛的生物学活性,通过与酪氨酸激酶受体、辅因子HS(HSPG)结合形成FGF-FGFR-HS复合物,经酪氨酸残基磷酸化激活后参与包括RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ和STAT途径在内的细胞内信号传导途径偶联[18]。本研究结果提示,鹤草茶的束胎功效涉及机体创伤修复过程,与调控血管新生相关蛋白因子的表达有关。仙鹤草富含皂苷,其总皂苷对黏膜的刺激性,是鹤草茶诱发机体创伤修复的相关因子表达的可能原因。

研究进一步采用免疫组化方式,对80 mg/mL鹤草茶组孕中期胚胎中的TNF和ER表达水平进行了分析。TNF是由激活的巨噬细胞产生的能抑制成骨细胞和刺激破骨细胞的细胞因子,研究发现雌激素性股骨头坏死患者血清中的TNF表达水平显著升高[19],TNF也可直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性,具有良好的抗炎与镇痛作用[20],是仙鹤草中类黄酮发挥抗炎抗氧化作用可能的靶标因子。本研究结果证实,鹤草茶可以提高80 mg/mL实验组胚胎中的TNF表达,但与对照组相比,无统计学差异(P＞0.05),而对ER表达水平没有影响。由于TNF在组织中的含量较低,因此虽本次试验中TNF升高的统计学意义不显著,但尚不能否定鹤草茶导致胚胎TNF表达升高所具有的生物学意义。