半夏厚朴汤标准汤剂质量标准研究

李 坤,李明花∗,秦文杰,杨晓宁,魏宝霞,倪 艳

(1.山西省中医药研究院,山西 太原030000；2.北京振东光明药物研究院有限公司,北京100085)

随着生活节奏的加快,人们面对生活、工作压力的情志波动起伏较大,进而造成气机不畅,致使梅核气等杂病的发生率明显增高[1]。梅核气是中医内科郁症范畴中的一种疾病,中医常用的治疗手段有药物治疗、针灸治疗及心理治疗[2-3]。其中,药物治疗多为理气剂,主要以行气、理气、降逆为主,代表方剂为半夏厚朴汤。

半夏厚朴汤源自汉代张仲景的《金匮要略》[4],原文记载：“妇人咽中如有炙脔,半夏厚朴汤主之”,本方由半夏、厚朴、茯苓、生姜、紫苏叶组成,五药合用,辛以开结,苦能降逆,具有行气散结、降逆化痰的功效[5],是主治咽喉部有异物感的专方[6]。现代研究表明,本方具有镇呕止吐、增进肠道功能、镇静催眠、抗抑郁等作用[7-8],临床上常用于梅核气、慢性咽炎、支气管哮喘、慢性胃炎等疾病的治疗且具有显著疗效[9-11]。但本方在临床上常以汤剂入药,存在服用量大、携带不便、患者依存性差的问题以及缺乏相应的质量控制标准等缺陷。因此,本研究基于配方颗粒标准汤剂的概念以半夏厚朴汤汤剂为前药,研究半夏厚朴汤标准汤剂的成型工艺,同时采用薄层鉴别及HPLC对半夏厚朴汤标准汤剂进行质量控制,建立本方标准汤剂的质量标准,为半夏厚朴汤颗粒的研究和质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695分析型高效液相色谱仪(二极管矩阵检测器,自动进样器；Empower Pro色谱工作站)；XSE205型分析天平(METTLER TOLEDO)；ME204电子天平(METTLER TOLEDO)；HH-6D1型电热恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；薄层自动点样仪(Linomat-Ⅳ,瑞士CAMAG公司)；薄层色谱成像仪(瑞士CAMAG公司)；Mili-Q5超纯水机；硅胶G薄层板(10 cm×10 cm,20171212,青岛海洋化工厂)；硅胶GF254薄层板(10 cm×10cm,20171126,青岛海洋化工厂)。

1.2 试药

甲醇(色谱纯,20200430,默克股份有限公司))；乙腈(色谱纯,JA059930,默克股份有限公司)；甲醇(分析纯,20170227,北京化工厂)；磷酸(分析纯,20171228,北京化工厂)；乙醇(分析纯,20180222,天津市福晨化学试剂厂)；乙酸乙酯(分析纯,20160802,天津市光复科技有限公司)；环己烷(分析纯,20140501,天津市永天化学试剂有限公司)；甲酸(分析纯,20141017,天津市福晨化学试剂厂)；乙醚(分析纯,20180201,北京化工厂)；三氯甲烷(分析纯,20170710,北京化工厂)；丙酮(分析纯,20121119,北京化工厂)；甲苯(分析纯,20170216,北京化工厂)；石油醚(分析纯,20170602,北京化工厂)；乙酸乙酯(分析纯,20130808,北京化工厂)；异丙醇(分析纯,20171222,北京化工厂)；香草醛(分析纯,20171220,北京化工厂)；硫酸(分析纯,20171227,北京化工厂)；乙醇(分析纯,20171118,北京化工厂)；超纯水(Milli-Q制)。

厚朴酚对照品(批号：110729-201513,98.8%)；和厚朴酚对照品(批号；110730-201614,99.3%)；迷迭香酸对照品(批号：111871-201706,90.50%)均购自中国食品药品检定研究院；6-姜辣素对照品(批号：j-019-170720,98.0%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；厚朴饮片均购买自山西振东道地药材有限公司,批号分别为；YP2018061101、YP2018061102、YP2018061103、YP2018061104、YP2018-061105、YP2018061106、YP2018061107、YP2018061108、YP2018061109、YP201806110110；半夏厚朴汤标准汤剂由北京振东光明药物研究院自制,批号分别为：BTD201808-15、BTD20180817、BTD20180821、BTD20180822、BTD201-80824、BTD20180825、BTD20180828、BTD20180904、BTD20180906、BTD20180910,分别编号为S1－S10。

2 方法与结果

2.1 半夏厚朴汤标准汤剂的制备

按原方剂量取半夏厚朴汤方中的五味饮片,加水回流提取2次。第一次加入10倍量水,浸泡30 min,回流提取30 min,滤过(100目),滤液另器收集。药渣再加入8倍量水,回流提取30 min,滤过(100目),滤液合并,低温减压浓缩至相对密度为1.07(50℃)的清膏,冷冻干燥,即得半夏厚朴汤冻干粉。

2.2 薄层鉴别

2.2.1 厚朴薄层鉴别[12]取半夏厚朴汤冻干粉0.5 g,精密称定,加甲醇25mL,超声处理30 min,过滤,滤液蒸干,残渣加水25mL使溶解,以乙醚振摇提取2次,每次25 mL,合并乙醚溶液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。再取厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品适量,加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照半夏厚朴汤制备方法,同法制备缺厚朴饮片的阴性对照样品,再按供试品溶液的制备方法,同法制备阴性对照样品溶液。照薄层色谱(通则0502)试验,吸取对照品溶液2μL,供试品溶液和阴性样品溶液各8μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以环己烷－乙酸乙酯－甲酸(15∶5∶0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,于紫外光(254 nm)下检视,结果见图1。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,且阴性无干扰。

图1 厚朴药材薄层鉴别

2.2.2 紫苏叶薄层鉴别[12]取半夏厚朴汤冻干粉2.0g,精密称定,加70%乙醇25mL,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加水25 mL使溶解,以三氯甲烷振摇提取2次,每次25 mL,弃去三氯甲烷溶液,水层蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。再取迷迭香酸对照品适量,加甲醇制成每1mL含1.0 mg的溶液,作为对照品溶液。照半夏厚朴汤制备方法,同法制备缺紫苏叶饮片的阴性样品,再按供试品溶液的制备方法,同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱(通则0502)试验,吸取对照品溶液2μL,供试品溶液和阴性样品溶液各3μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷－乙酸乙酯－异丙醇－甲酸(10∶5∶3.5∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,于105℃加热至斑点显色清晰,于紫外光(366 nm)下检视,结果见图2。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,且阴性无干扰。

图2 紫苏叶药材薄层鉴别

2.2.3 生姜薄层鉴别[12]取半夏厚朴汤冻干粉2.0 g,精密称定,加甲醇25 mL,超声处理30 min,过滤,滤液蒸干,残渣加水25 mL使溶解,以乙酸乙酯振摇提取2次,每次25mL,合并乙酸乙酯溶液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取6-姜辣素对照品适量,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作为对照品溶液。照半夏厚朴汤制备方法,同法制备缺生姜饮片的阴性样品,再按供试品溶液的制备方法,同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱(通则0502)试验,吸取对照品溶液2μL,供试品溶液和阴性样品溶液各5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90℃)－三氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(10∶5∶5∶0.3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,于105℃下加热至斑点显色清晰,检视,结果见图3。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,且阴性无干扰。

图3 生姜药材薄层鉴别

2.3 含量测定

2.3.1 厚朴饮片含量测定 按照2015年版《中国药典》一部厚朴含量测定项下的方法测定10批厚朴饮片中厚朴酚与和厚朴酚的含量,得厚朴酚与和厚朴酚的总量为2.76%～3.02%,见表2。结果表明10批厚朴饮片均满足药典(含厚朴酚与和厚朴酚的总量不得少于2.0%)的限量要求。

2.3.2 标准汤剂含量测定 色谱条件：以Phenomenex C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm)为色谱柱；以甲醇－水(78∶22)为流动相；检测波长：294 nm；柱温：25℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10μL；理论板数按厚朴酚计算应不低3 000。

溶液的制备：(1)混合对照品溶液的制备。取厚朴酚对照品与和厚朴酚对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含30μg的厚朴酚与10μg的和厚朴酚混合对照品溶液,即得。(2)供试品溶液的制备。取本品1.0 g,精密称定,精密加入70%甲醇10 mL,密塞,称定重量,超声处理(功率500 W,频率40 k Hz)30 min,取出,放冷,再称重,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过(0.45μm的微孔滤膜),取续滤液,即得。(3)阴性对照溶液的制备。照半夏厚朴汤标准汤剂制备方法,同法制备缺厚朴饮片的阴性样品,再按“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法,同法制备厚朴阴性对照溶液。

2.3.3 方法学考察 (1)专属性试验。分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μL,按“2.3.2”项下色谱条件分别进样检测,记录其色谱,结果见图4。结果表明,阴性对检测结果无干扰,提示专属性良好。

图4 专属性色谱

(2)线性关系考察。分别精密量取“2.3.2”项下的混合对照品分别用甲醇稀释0、2、5、10、20、50、100倍,按“2.3.2”项下的色谱条件进样测定,记录峰面积。以厚朴酚、和厚朴酚对照品浓度X(mg/mL)为横坐标,以峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线,并进行线性回归,得厚朴酚的回归方程为Y＝15 411X＋15 915,相关系R2＝0.999 5,表明厚朴酚在0.2～17.1μg的含量范围内线性良好；和厚朴酚的回归方程为Y＝15 495X＋331 925,相关系数R2＝0.999,表明和厚朴酚在0.2～19.7μg的含量范围内线性良好。

(3)精密度试验。取半夏厚朴汤标准汤剂(批号：BTD20180815)供试品约1.0 g,精密称定,按供试品溶液制备项下制备样品溶液,精密吸取供试品溶液10μL,连续进样6次,再按上述色谱条件连续进样测定,记录峰面积。结果厚朴酚、和厚朴酚的峰面积RSD分别为0.13%、0.16%,表明仪器精密度良好。

(4)稳定性试验。取同一批半夏厚朴汤标准汤剂(批号：BTD20180815)供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、12、24小时进样测定,记录色谱峰峰面积。结果表明,厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD分别为0.66%,0.57%,表明供试品溶液在24 h内稳定良好。

(5)重复性试验。取同一批半夏厚朴汤标准汤剂(批号：BTD20180815),按“2.3.2”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液,进样测定。计算6份供试品中厚朴酚与和厚朴酚的含量,结果表明,样品中厚朴酚、和厚朴酚的平均含量分别为0.097%、0.060%,RSD分别为0.36%、0.34%,表明本方法的重复性良好。

(6)加样回收率试验。取同一批半夏厚朴汤标准汤剂(批号：BTD20180815)供试品约0.5 mg,共6份,精密称定,分别向其中加入厚朴酚对照品0.48 mg与和厚朴酚0.30mg,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,进样测定,计算厚朴酚与和厚朴酚的平均加样回收率。结果表明,厚朴酚、和厚朴酚平均回收率分别为106.36%,102.85%,RSD分别为3.91%、3.50%。

(7)样品含量测定。取10批半夏厚朴汤标准汤剂冻干粉,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.3.2”项下色谱条件测定厚朴酚与和厚朴酚的含量,并计算其总转移率,见表1。结果表明,10批标准汤剂的出膏率为11.25%～12.95%,平均值为11.80%；厚朴酚和和厚朴酚的总转移率为4.74%～5.62%,平均值为5.45%。

表1 半夏厚朴汤标准汤剂含量测定结果 (%)

3 讨论

3.1 制备工艺

半夏厚朴汤古方记载[13]制法“以水七升,煮取四升,分温四服,日三夜一服”,本研究分别采用原方原工艺及《医疗机构中药煎药室管理规范》对半夏厚朴汤标准汤剂进行工艺研究。结果发现,以原方工艺进行其煎煮时间过短不符合现代临床煎药习惯,故本研究最终以《医疗机构中药煎药室管理规范》为煎煮工艺研究依据。即选取合格单味饮片,以水为提取溶剂,照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮,经固液分离,低温减压浓缩,冷冻干燥后制得。

3.2 薄层鉴别

经研究建立方中厚朴、紫苏叶、生姜TLC方法且专属性良好。此外,本研究曾尝试对处方半夏中的氨基酸类成分、生物碱类成分、有机酸类成分以及茯苓中的三萜类成分进行薄层鉴别方法建立,但经过更换供试品制备方式、展开条件、显色剂种类等方法其结果均显示阴性干扰,故未将半夏和茯苓二者纳入质量标准。

3.3 含量测定

研究表明[14-15],厚朴酚与和厚朴酚为半夏厚朴汤的主要药效成分,故本研究以厚朴酚与和厚朴酚为指标建立含量测定方法,以控制本品的质量。本研究通过考察色谱条件及供试品制备方式,确定最佳色谱条件且方法验证符合含量测定要求。此外,本研究曾尝试采用HPLC法建立方中君药半夏中生物碱及琥珀酸的含量测定方法,但结果均不符合HPLC测定要求,故未将君药半夏的HPLC含量测定方法纳入半夏厚朴汤标准汤剂的质量标准。