miR-631的表达与卵巢上皮性癌预后的关系

余丹扬，梁宗文，徐超逸，颜林志，陈枫，朱家玮，段萍

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 妇产科，浙江 温州 325027）

在生殖系统恶性肿瘤中，卵巢癌是女性的首要致死原因，有研究显示女性因卵巢癌而病死的人数占总癌症病死数的6%[1]。卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是卵巢癌的主要组织学类型之一，它又分为浆液性、黏液性、子宫内膜样、透明细胞腺癌4种亚型。75%～80%的卵巢癌为卵巢浆液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocar-cinoma，OSC），预后极差[2-3]。鉴于OSC患者的5年存活率极低（约30%），识别新的预后指标，为患者提供早期有效的治疗是我们的新目标[4]。

miRNA是一种约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种重要细胞活动的调控[5-6]。但miR-631在EOC中的作用尚未见报道。本研究从TCGA数据库中提取570例卵巢癌患者的临床病理信息和相应的miR-631的表达量，分析miR-631的表达量与EOC患者临床病理特征和预后的关系，并探讨miR-631对EOC细胞迁移的作用及对裸鼠成瘤体积的影响，探讨miR-631表达水平与EOC患者预后的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、动物、试剂的来源:人卵巢癌细胞株ES2、A2780、COV504、SKOV3均来自中山大学肿瘤防治中心、华南肿瘤学国家重点实验室，RPMI1640培养基、DMED培养基、胎牛血清均购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司。miR-631类似物（miR-631 mimic）及其阴性对照药品（mimic NC）、miR-631抑制物（miR-631 inhibitor）及其阴性对照药品（inhibitor NC）均购于广州瑞博生物技术有限公司，Lipofectamine 2 000脂质体试剂盒购于北京英格恩生物科技有限公司，BALB/C-nu/nu裸小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号:SYXK（京）2017-0033]。

1.1.2 从TCGA数据库中获得数据:2018年11月从癌症和肿瘤基因图谱（Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（http://www.firebrowse.org/）中提取570例EOC患者的临床资料及其相应miRNA序列表达数据。收集的临床病理及生存数据包括:年龄、人种、肿瘤分级、临床分期、肿瘤分布位置、肿瘤坏死情况、淋巴浸润、血管侵袭等情况，以及患者的生存状态和总生存时间。

1.2 细胞实验

1.2.1 EOC细胞株的细胞培养:挑选miR-631低表达的EOC细胞株A2780、COV504和miR-631高表达的细胞株ES2和SKOV3。严格参照Lipofectamine 2 000脂质体试剂盒说明书进行操作，分别将miR-631 mimic及mimic NC转染细胞株A2780和COV504，miR-631 inhibitor及inhibitor NC转染细胞株ES2 和SKOV3。A2780细胞用含10% FBS的DMED培养基培养，ES2、SKOV3、COV504细胞用含10% FBS的RPMI1640培养基培养。所有细胞均于37 ℃，5% CO2的湿化培养箱内培养。

1.2.2 细胞迁移能力测定:将处于对数生长期的细胞于前1天换为无血清培养基，饥饿培养12～24 h。次日消化离心后用PBS洗涤1～2 遍，调整细胞密度至1×106/mL。向transwell小室上层加入5×104～1×105个细胞，补足其体积至200 μL；下层加入700 μL含10%～20% FBS的培养基，37 ℃培养24～48 h；取出transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗2遍，甲醇固定15 min后，PBS洗2遍；结晶紫染色15～20 min，用清水洗涤至无结晶紫残留；拭去上室残留细胞置于显微镜高背景视野下随机选择5个视野计数并进行统计学分析。

1.3 裸鼠皮下成瘤实验

1.3.1 接种前细胞培养:实验细胞分为2组，分别为miR-631类似物组与对照组，miR-631类似物组为转染miR-631 mimic的A2780细胞株，对照组为转染mimic NC的A2780细胞株，扩大培养接种细胞。待细胞足够后，消化处于对数生长期，生长状态良好的细胞并计数，PBS重悬细胞，调整其终浓度为1×107/mL。把细胞置于冰上，准备接种裸鼠。

1.3.2 裸鼠皮下种植:BALB/C-nu/nu裸小鼠10只，4～6周，随机平均分成2组，分别为miR-631类似物组和对照组，miR-631类似物组裸鼠接种转染miR-631类似物的A2780细胞株，对照组裸鼠接种转染miR-631类似物阴性对照药品的A2780细胞株，接种细胞前应充分重悬混匀细胞，用1 mL注射器吸取细胞悬浮液，在右侧背部偏后侧皮下接种1×106个细胞/只，即每只100 μL。

1.3.3 观察裸鼠成瘤情况:种植7 d后开始观察裸鼠成瘤情况，皮下瘤长至一定体积后，完整分离每只裸鼠的肿瘤，记录及拍照。拍照结束后一部分皮下瘤组织置于-80 ℃冰箱中，以待以后用于提取组织蛋白以及RNA；另一部分皮下瘤组织用4%中性甲醛固定组织，并委托病理科浸蜡包埋后切片。实验结束后，所有裸鼠经戊巴比妥钠麻醉后颈椎脱臼安乐死。

1.4 统计学处理方法

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。根据该TCGA队列EOC患者的生存情况及miR-631表达量，采用X-tile软件（美国耶鲁大学）获得该队列的最佳截断值。利用获得的最佳截断值，将纳入的EOC患者分为高表达组和低表达组。总生存时间主要定义为从确诊到死亡或最后一次随访的时间跨度。采用χ2检验或Fisher精确检验来评价2组变量的分布差异。绘制Kaplan-Meier曲线，比较miR-631高表达组与miR-631低表达组的生存差异；采用Mantel-COX对数秩检验来计算P值。EOC患者预后影响因素分析采用COX比例风险模型。所有生存相关曲线均使用GraphPad Prism 7绘制。2组定量资料比较采用独立样本t 检验或者配对t 检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库中卵巢癌患者的临床特点

从TCGA数据库中提取卵巢癌患者信息，其中包括570例EOC患者的临床病理信息和相应的miR-631的表达量。患者年龄为59（26～90）岁。X-tile软件分析显示miR-631表达的最佳截断值为4.78，并将患者分为miR-631低表达组（miR-631相对表达量＜4.78）和miR-631高表达组（miR-631相对表达量≥4.78）。见图1。2组间临床病理学特征差异无统计学意义（数据文中未显示）。

2.2 miR-631表达的预后意义

miR-631低表达组EOC患者OS明显差于miR-631高表达组（HR=1.55，95%CI=1.12～2.14，P=0.008），见图2。随后，使用单因素及多因素COX回归分析来评价miR-631表达的影响和其他临床病理因素对EOC患者的影响（见表1）。在多因素COX回归分析中，我们发现miR-631的低表达是影响EOC患者OS下降的独立因素（HR=1.39，95%CI=1.03～1.87，P=0.029）。年龄、残余肿瘤大小及临床分期与OCS患者预后也有显著相关性（P＜0.05）。

2.3 miR-631抑制EOC细胞的迁移

图2 miR-631高表达组和低表达组EOC患者的生存曲线图

我们选择了2种miR-631低表达的EOC细胞株:A2780、COV504，发现在这2种细胞株中，增加miR-631的表达明显地降低了细胞的迁移能力（见图3）。相反的，我们选择了2种miR-631高表达的EOC细胞株:ES2、SKOV3，发现在ES2细胞株中，与对照组相比，下调miR-631的表达可以显著地提高细胞的迁移能力；在SKOV3细胞株中我们观察到了相似地结果（见图4）。

表1 570例卵巢癌患者miR-631的表达与临床特征的COX回归分析

2.4 在EOC裸鼠模型中miR-631减小肿瘤体积

我们选择了miR-631低表达的A2780细胞株建立EOC裸鼠皮下模型，发现在活体模型中，上调miR-631的表达可以减小肿瘤体积（见图5）。

3 讨论

EOC占所有卵巢癌的85%～90%[7]。每年全世界有超过220 000名女性被诊断患有EOC[8]。但是，由于缺乏有效的筛查策略，近70%的EOC患者被诊断为晚期，而晚期患者的5年总生存率仍然停滞不前，大约40%[9]。此外，晚期EOC患者易于复发并且对化疗耐药[8]。因此，迫切需要确定一些生物标志物，以预测患者的预后及术前治疗的个人指导[10]。

图3 miR-631类似物抑制EOC细胞株A2780、COV504的迁移能力

图4 miR-631抑制物促进EOC细胞株ES2、SKOV3的迁移能力

图5 2组EOC裸鼠模型肿瘤体积的变化

近年的研究表明，miRNAs表达失调已成为各种肿瘤共有的特征，其作为一类新的分子研究靶点用于肿瘤的诊断和治疗，已倍受肿瘤界的关注[11-13]。而miRNA是一种大小为19～25个核苷酸的非编码单链小RNA分子，作为基因表达调控因子在转录后水平调节基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种重要细胞活动的调控[14]。许多研究报道了一系列miRNA，如:miR-181a、miR-34a、miR-211、miR-199a-3p、miR-193b、miR-338-3p、miR-200、miR-141、miR-145等表达失调与EOC的发生发展密切相关[15-23]。YU等[24]发现miR-631可以通过调节磺基转移酶亚基1A1（SULT1A1）而影响酶的活性；XI等[25]研究表明miR-631/UbcH10/MDR1通路与骨髓瘤细胞中硼替佐米耐药的发展密切相关，miR-631的过表达可显著提高耐药性骨髓瘤细胞的硼替佐米敏感性。但miR-631在EOC中的作用尚未见报道。

在本研究中，我们利用TCGA数据库提取570例EOC患者的临床病理信息和相应的miR-631的表达量，识别miR-631在EOC患者中的临床意义。生存分析结果显示，miR-631低表达的EOC患者总生存率较miR-631高表达的患者短。随后的单变量和多变量COX回归分析也表明，miR-631是EOC患者预后较差的独立因素。以上结果表明，miR-631的低表达可能与EOC患者预后较差有关。为进一步验证miR-631与EOC预后的关系，利用Transwell试验，检测miR-631对卵巢癌细胞株的迁移能力的影响，发现上调miR-631表达可以抑制卵巢癌细胞的迁移，而下调其表达可促进卵巢癌细胞的迁移。为了更深入地研究miR-631对EOC预后的影响，我们建立了EOC动物模型，在EOC裸鼠模型中我们发现增加miR-631的表达量可以显著减小肿瘤的体积，对EOC起抑制作用。

综上所述，我们得出miR-631的低表达与EOC患者预后较差有关。在将来，miR-631有可能可以作为一个预测EOC预后的有效靶点，为EOC患者的治疗提供指导。