急性心肌梗死病人外周血miR-486、miR-150的表达水平及其临床意义

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于持续性和严重缺血引起的心肌组织急性坏死[1]。AMI是发病率最高的心血管疾病之一，其死亡率和致残率极高，严重威胁病人生命及生活质量。及时诊断对于控制AMI的发展、给予适当治疗、降低死亡率、改善预后至关重要。目前，心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等常规生物标志物被广泛用于临床诊断，但诊断特异性有限[2]。寻找敏感性、特异性较高的AMI新型诊断标志物具有积极临床意义。随着分子生物学相关技术的进步，基于核苷酸的生物标志物在疾病诊断和预后判断中的价值受到关注。大量研究表明，微小RNA(miRNA)在多种生物学过程中起重要作用，且其在组织中的异常表达导致各种疾病，如癌症和心血管疾病[3-4]。另外，miRNA在外周血或血浆中非常稳定且容易检测[5]。这些特点表明miRNA可作为AMI诊断的潜在生物标志物。本研究旨在评估AMI病人外周血miR-486、miR-150水平，确定miR-486、miR-150是否可以作为AMI早期诊断的新型生物标志物，探讨外周血miR-486、miR-150水平与AMI疾病类型的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年4月—2017年8月重庆市永川区人民医院心血管内科住院治疗的AMI病人136例作为研究对象。年龄(58.53±12.01)岁；男78例，女58例。其中80例被诊断为ST段抬高型心肌梗死(STEMI组)，56例被诊断为非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI组)。AMI诊断标准：①急性缺血性胸痛；②心电图异常(病理性Q波，ST段抬高或抑制)；③心肌坏死标记物[肌钙蛋白(cTn)和肌酸激酶(CK)]的水平超过正常范围上限的两倍。纳入标准：①所有病人均符合AMI诊断标准；②病人症状出现后24 h内入院；③无心肌梗死或经皮冠状动脉介入(PCI)史；④所有病人临床病例资料均完整；⑤所有病人及其家属均知情同意。排除标准：①伴血液学疾病；②伴急性或慢性感染；③伴肝功能不全、肾衰竭；④恶性肿瘤病史。另选择同期于本院体检的健康成年志愿者(心电图正常，无心血管疾病史)100名作为对照组，其中男64名，女36名；年龄(58.37±11.54)岁。

1.2 标本采集 抽取病人入院及健康者体检时的静脉血样本5 mL，置于EDTA抗凝管中，4 ℃，3 000 r/min，离心10 min，分离上清液，并于4 ℃，12 000 r/min，离心10 min。收集血浆，置于-80 ℃储存备用。

1.3 RNA提取 采用miRNeasy Serum/P；asm试剂盒(北京Qiagen公司)，根据制造商说明书从血浆中提取总RNA。将RNA溶于20 μL经焦碳酸二乙酯处理的水中。采用NanoDrop2000c分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定RNA样品的浓度和质量。

1.4 实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR) 采用TaqMan人微小RNA测定试剂盒(美国Applied Biosystems公司)，根据制造商说明书检测miR-486和miR-150表达水平。将血浆样品RNA浓度稀释至180 ng/μL。15 μL RT反应体系：100 mM dNTPs 0.3 μL，MultiScribe逆转录酶(50 U/μL)3 μL，10×RT缓冲液1.5 μL，RNA酶抑制剂(20 U/μL)0.19 μL，RT引物6 μL，RNA样品3 μL，无核酸酶水1.01 μL。将试剂混合物置于16 ℃孵育30 min、42 ℃孵育30 min、85 ℃孵育5 min，RT产物置于-20 ℃储存待测。20 μL PCR反应体系：20×TaqMan MicroRNAassays 1.0 μL，RT产物0.16 μL，TaqMan Universal Master Mix Ⅱ 10 μL，No AmpErase UNG(2×)，无核酸酶水8.84 μL。PCR循环由95 ℃ 10 min初始变性、95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s的40个循环两部分组成。以U6 snRNA作为内部标准化参考。每个样本测量一式3份。miRNA的相对表达采用2-ΔΔCt法进行计算。

2 结 果

2.1 3组临床资料比较 3组年龄、性别、高血压、高脂血症、糖尿病、吸烟及体格检查指标等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。3组白细胞计数(WBC)、CK-MB、心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)和左室射血分数(LVEF)比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 3组临床资料比较

注：TC为总胆固醇，TG为三酰甘油，HDL为高密度脂蛋白，LDL为低密度脂蛋白，BUN为尿素氮；1 mmHg=0.133 kPa

2.2 两组外周血miR-486、miR-150表达水平比较 与对照组比较，AMI组病人外周血miR-486、miR-150水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

组别例数miR-486miR-150AMI组1361.78±0.171.47±0.16对照组1001.03±0.021.02±0.03t值43.87127.754P0.0000.000

2.3 外周血miR-186和miR-150表达水平对AMI的诊断价值 ROC曲线分析显示，miR-486和miR-150在AMI早期阶段表现出对AMI组病人与对照组之间的强区分能力。miR-486对AMI病人诊断的AUC为0.732(P<0.001)，敏感性为0.564，特异性为0.848；miR-150对AMI病人诊断的AUC为0.681(P<0.001)，敏感性为0.516，特异性为0.793。详见图1。

图1 外周血miR-486和miR-150对AMI诊断的ROC曲线分析

2.4 STEMI和NSTEMI病人miR-486、miR-150表达水平比较 与对照组比较，STEMI和NSTEMI病人外周血miR-486和miR-150水平均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。STEMI病人外周血miR-486和miR-150水平均高于NSTEMI病人，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

组别例数miR-486miR-150STEMI组801.81±0.191.51±0.16NSTEMI组561.73±0.171.42±0.15对照组100 1.03±0.021.02±0.03t1-2,P2.522,0.0133.312,0.001t1-3,P40.799,0.00029.993,0.000t2-3,P40.777,0.00025.822,0.000

注：t1-2为STEMI vs NSTEMI；t1-3为STEMI vs 对照组；t2-3为NSTEMI vs 对照组

2.5 外周血miR-186和miR-150表达水平对STEMI的诊断价值 ROC曲线分析显示，miR-486和miR-150对STEMI组与对照组有较高区分能力。miR-486对STEMI病人诊断的AUC为0.701(P<0.001)，敏感性为0.574，特异性为0.798。miR-150对STEMI病人诊断的AUC为0.641(P<0.001)，敏感性为0.794，特异性为0.429。详见图2。

图2 外周血miR-486和miR-150对STEMI诊断的ROC曲线分析

2.6 外周血miR-486和miR-150表达水平对NSTEMI的诊断价值 ROC曲线分析显示，miR-486和miR-150对NSTEMI组与对照组有较高区分能力。miR-486对NSTEMI病人诊断的AUC为0.785(P<0.001)，敏感性为0.674，特异性为0.835。miR-150对NSTEMI病人诊断的AUC为0.736(P<0.001)，敏感性为0.819，特异性为0.577。详见图3。

图3 外周血miR-486和miR-150对NSTEMI诊断的ROC曲线分析

3 讨 论

AMI是临床上常见的心脑血管疾病。由于其发病突然、进展迅速、死亡率高，已成为目前威胁人类健康的主要疾病之一[6]。早期发现、准确诊断和靶向治疗对AMI病人的预后改善具有重要临床意义。临床研究表明，AMI发病初期没有明显临床症状，只有50%的病人心电图(ECG)异常[7]。cTnT作为AMI早期临床诊断常用的外周血标志物，具有较高特异性和敏感性。然而，研究表明，在急性和慢性肾衰病人中也观察到cTnT表达的升高。因此，探寻更具体的血清标志物对AMI的临床诊断具有重要价值。

miRNA是小的非编码RNA，其长度为17～27个核苷酸。miRNA能够与目标mRNA的3′UTR配对，导致蛋白质翻译抑制、靶标降解或基因沉默，从而发挥基因表达序列特异性调节因子的作用[8]。研究表明，miRNA在多种生物学过程中起重要作用，包括增殖、分化、发育和凋亡等[9]。研究证实，miRNA的异常表达与包括AMI在内的多种疾病的发生、发展密切相关，是许多疾病发病机制中的重要调节因子[10]。miRNA可以被细胞输出或释放至血液中，在外周血或血浆中非常稳定且容易检测到。另外，miRNA具有组织特异性，在特定病理条件下，外周血miRNA的水平也存在差异。鉴于这些优点，外周血miRNA可以作为各种疾病诊断和预后判断的生物标志物，尤其在心血管疾病的诊断中具有较好的应用前景[11]。然而，关于AMI病人中外周血miRNA表达的研究仍十分有限。miR-486是肌肉中富含的一种miRNA，是心肌/骨骼肌中的一种有效调节因子，在杜兴氏肌营养不良和去神经支配诱导的肌肉萎缩等几种肌肉疾病中下调[12]。miR-486过表达可能导致肌肉肥大。研究表明，AMI病人外周血miR-486表达上调可能与心肌肥厚有关[13]。miR-150是一种与炎症有关的miRNA，与各种心脑血管疾病的发病机制有关[14]。血浆样品的微阵列筛选结果显示，肺动脉高压病人miR-150水平显著低于健康对照者，且血浆miR-150水平是肺动脉高压病人生存期的有效预测因子[15]。在不稳定型心绞痛病人血清中也观察到miR-150表达的异常，且对不稳定型心绞痛的诊断准确率较高[16]。研究表明，miR-150可能通过直接抑制心肌细胞中的促凋亡基因egr2和p2x7r来抑制缺血性损伤期间心脏的结构和功能重构[17]。

有研究通过对AMI病人和健康对照者进行血浆miRNA微阵列芯片分析发现，AMI病人中miR-486和miR-150的表达水平发生变化[18]。本研究qRT-PCR结果显示，AMI组血浆miR-486和miR-150水平均高于对照组，提示miR-486和miR-150的上调可能是AMI发病的原因之一。进一步ROC分析发现，miR-486和miR-150对AMI诊断的AUC分别为0.732、0.681，且表现出对AMI组与对照组的强区分能力，提示外周血miR-486和miR-150对AMI的诊断具有较高诊断价值，且miR-486的诊断价值更优。

根据心电图(ECG)变化可将AMI病人分为STEMI组和NSTEMI组。其中，STEMI病人主要症状在于梗死相关动脉被纤维蛋白血块闭塞，及时给予再灌注治疗是最有效的方法[19]。而NSTEMI病人主要症状在于梗死相关动脉部分被富含血小板的血块阻塞，及时给予初始保守策略或初始侵入策略即可有效改善病人病情[20]。因此，AMI的准确诊断对控制病情进展、选择适当治疗方式、降低死亡率、改善预后至关重要。虽然ECG作为临床上AMI诊断及疾病类型鉴别的常用工具，具有较高诊断价值，然而，由于NSTEMI病人往往缺乏典型症状，心电图中ST段也会出现明显升高现象，检测易出现误诊。寻找敏感性、特异性较高的AMI疾病类型鉴别诊断标志物，对疾病的靶向治疗具有积极临床意义。

本研究分析STEMI病人和NSTEMI病人外周血miR-486和miR-150水平发现，STEMI病人外周血miR-486和miR-150水平均高于NSTEMI病人，提示外周血miR-486和miR-150水平可能与特定类型的AMI相关。进一步采用ROC曲线分析显示miR-486和miR-150对STEMI组或NSTEMI组与对照组之间有强区分能力，且miR-486诊断STEMI病人和NSTEMI病人的AUC分别为0.701、0.785，miR-150诊断STEMI病人和NSTEMI病人的AUC分别为0.641、0.736，提示miR-486和miR-150对STEMI和NSTEMI病人的鉴别均具有较高诊断价值，且对NSTEMI病人的诊断价值更优。

综上所述，AMI病人外周血miR-486和miR-150水平显著升高，对AMI的诊断具有较高诊断价值，且miR-486和miR-150水平在STEMI和NSTEMI病人中差异有统计学意义，对STEMI和NSTEMI的诊断具有一定价值，miR-486和miR-150可能是诊断AMI的合适生物标志物。