miR-210对急性心肌梗死早期的诊断价值

急性心肌梗死(AMI)是全球死亡和残疾的主要原因之一，每6例AMI病人中死亡1例[1]。AMI的快速正确诊断在疾病的治疗和预后中起着重要作用。在过去几十年中，AMI的诊断、治疗和预后方面取得了巨大进展。特别是AMI生物标志物的研究进展引起了人们的极大关注。目前，心肌肌钙蛋白(cTn)是临床实践中用于诊断AMI的最常见生物标志物。然而，cTn测定在AMI发病后的即刻阶段缺乏足够的敏感性，临床上仍然需要新的生物标志物，在入院时快速可靠地诊断或排除AMI。微小RNA(microRNA，miR)是调节特定信使RNA的稳定性和(或)翻译效率的非编码RNA分子。研究表明，miR是AMI早期诊断潜力巨大的新型生物标志物[2]。miR的组织表达水平的异常变化与心脏病直接相关。除了组织中的表达变化之外，近期的研究表明，miR以高度稳定的形式在血清、血浆、尿液和其他体液中检测到，从而不受内源性核糖核酸酶活性的抑制影响[3]。由于miR在外周血表达稳定，可以反映疾病发生、进展和严重程度，加上可以反复冻融及长期储存，因此人血浆中miR检测在心血管疾病中的诊断潜力逐渐成为研究的热点[4]。研究证实，miR-210通过缺氧诱导因子(HIF)-1α参与心肌缺血缺氧反应，其活性与线粒体代谢、血管生成、细胞增殖、细胞分化、凋亡细胞死亡等有关[5-6]。目前miR-210在AMI病人中的表达水平及其临床意义尚不清楚，相关的研究极少。本研究旨在分析miR-210在AMI病人血浆中的表达变化，探讨miR-210在诊断AMI中作为新的生物标志物的潜在作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2015年1月—2016年11月因急性胸痛发作6 h内急诊入院，行冠状动脉造影术，最终确诊为AMI的病人65例作为AMI组，不稳定型心绞痛(UAP)病人40例作为UAP组。纳入标准：①有胸痛症状，发病在6 h内入院；②心电图、心肌标志物或心肌酶谱等指标符合2007年美国心脏病学学会(ACC)/美国心脏协会(AHA)制定的心肌梗死标准[7]；③冠状动脉造影检查显示有1支以上的冠状动脉血管狭窄超过50%；④经医院伦理委员会批准，病人自愿参加，签署知情同意书。排除标准：①因急性创伤、肺栓塞、主动脉夹层等引起的胸痛；②合并有肝肾功能不全、心脏瓣膜病、恶性肿瘤等疾病。另选取30名健康体检者作为对照组，其中，男18例，女12例；年龄51～68(58.2±6.2)岁。

1.2 血浆肌钙蛋白T(cTnT)检测 病人在急诊入院即刻抽取静脉血，健康体检者于清晨空腹采集静脉血。采用全自动电化学发光免疫分析仪(罗氏公司Elecsys2010)测定cTnT。cTnT>0.5 ng/mL为AMI诊断参考值。

1.3 血浆miR-210检测 病人采集静脉血后，加入EDTA抗凝管中，3 000 r/min离心10 min 后分离血浆，随后以12 000 r/min离心10 min，取上清液置于无RNA酶的EP管中，-80 ℃冰箱保存，集中待测。具体操作步骤：①总RNA抽提。使用TRIzol试剂(Invitrogen)根据说明书从血清中分离总RNA。通过无RNase水洗涤，收集总RNA，然后使用NanoDrop ND-1000核酸定量检测仪检测RNA浓度和纯度。②qRT-PCR：按照TaqMan microRNA逆转录试剂盒说明书(Ambion)进行逆转录，定量检测血浆样品中miRNA。根据GenBank数据库提供的核酸序列设计PCR引物。miR-210：上游引物5'-CATGATCAGAGATCAGCCGA-3'；下游引物5'-CTGTGCTGGTGGCATACGTGAT-3'。使用U6作为miR-210表达的内部对照。U6：上游引物5'-CGTAGTCCGTGCTCAGTGGA-3'；下游引物5'-ATACGCTGCTACCTGACCTCAG-3'。采用TaqMan Universal PCR master mix试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，qPCR在7300实时PCR反应体系(美国ABI公司)上进行，反应条件为95 ℃下孵育10 min，随后40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。使用2-ΔΔCT方法计算相对表达水平。

2 结 果

2.1 临床资料比较 3组年龄、性别、体质指数(BMI)既往病史等基线特征比较，差异无统计学意义(P>0.05)。3组血浆cTnT水平比较，差异有统计学意义(F=158.678，P=0.000)，进一步两两比较，AMI组和UAP组cTnT水平明显低于对照组(P<0.05)；AMI组cTnT水平明显低于UAP组(P<0.05)。详见表1。

2.2 3组血浆miR-210水平比较 3组血浆miR-210水平比较，差异有统计学意义(F=102.994，P=0.000)；进一步两两比较，AMI组和UAP组 miR-210水平明显高于对照组(均P<0.01)；AMI组miR-210水平明显高于UAP组(P<0.01)。详见图1。

2.3 血浆miR-210与cTnT的相关性分析 AMI组和UAP组病人miR-210与cTnT水平呈正相关(r=0.644，P=0.000)。详见图2。

表1 3组临床资料比较

与对照组比较，1)P<0.05；与UAP组比较，2)P<0.05

图1 3组血浆miR-210水平比较

图2 血浆miR-210与cTnT的相关性分析

2.4 血浆miR-210、cTnT对早期诊断AMI的价值分析 ROC曲线分析miR-210、cTnT早期诊断AMI的价值，miR-210的ROC曲线下面积(AUC)为0.885[95%CI(0.822～0.949)，P=0.000]，当miR-210值为6.0时，敏感度为78.5%，特异度为92.5%，阳性预测值94.4%，阴性预测值72.5%；cTnT的AUC为0.878[95%CI(0.815～0.941)，P=0.000]，当cTnT值为0.94时，敏感度为61.5%，特异度为75.0%，阳性预测值95.2%，阴性预测值70.3%；miR-210、cTnT联合检测的AUC值为0.933[95%CI(0.887～0.978)，P=0.000]，灵敏度为96.9%，特异度为93.2%，阳性预测值95.2%，阴性预测值82.9%。详见图3。

图3 血浆miR-210、cTnT对早期诊断AMI的ROC曲线分析

3 讨 论

miR-210基因位于第11号染色体短臂的末端(11p15.5)，其靶基因多达50余个。miR-210通过调控这些靶基因的表达，参与体内各种生理与病理代谢过程[8]。研究证实，miR-210参与了多种心血管疾病的生理和病理过程[9]。Bostjancic等[10]研究发现，在发生AMI后，miR-210相对表达水平增高。Wang等[11]研究发现，活血化瘀方剂可有效减少大鼠AMI面积，改善间质纤维化及心功能，这些作用可能与通过miR-210及血管内皮生长因子(VEGF)表达上调，促进心肌血管生成有关。miRNA在细胞中对缺氧和缺血性心血管疾病反应中的关键作用，表明microRNA是一类新兴的治疗靶点[12]。

缺氧是缺血性心血管疾病的关键致病因素。内皮及心肌组织在细胞缺氧损伤期间，miR-210水平明显增加。血浆miR-210可能来源于缺血坏死的心肌及内皮细胞。其机制可能是缺氧刺激心肌细胞系，通过低氧诱导因子α1刺激miR-210产生增多，从而释放入血，导致血浆水平明显增高[13]。miR-210可以通过促进血管生成来改善心脏功能并抑制细胞凋亡，提示通过相关载体递送miR-210具有治疗缺血性心脏病的治疗潜力。目前有关miR-210在AMI病人血浆中的表达水平及其诊断价值相关的报道极少。本研究结果显示，血浆miR-210在AMI及UAP病人中相对表达水平明显高于健康对照者，AMI组miR-210水平明显高于UAP组。提示血浆miR-210有可能是心肌梗死诊断的潜在生物标志物。进一步研究发现，AMI和UAP病人miR-210与cTnT水平呈正相关，ROC曲线分析显示，miR-210、cTnT的AUC值分别为0.885、0.878，根据Swets的诊断标准，当AUC在0.7～0.9时，ROC曲线更准确，AUC>0.9表示高准确率。因此，与AMI经典诊断指标cTnT相比，miR-210具有相似的诊断AMI能力。此外，miR-210与cTnT对AMI的诊断均有较高的敏感度和特异性，对于AMI具有可靠的诊断价值，两者联合检测其AUC值为0.933，其灵敏度和特异性均高于单一指标，因此，联合检测miR-210和cTnT，有助于更为准确地早期诊断AMI。miR-210可能是AMI早期诊断潜在的新型生物标志物。

miR-210具有早期诊断AMI的潜在价值。但miR-210是否能作为AMI诊断的生物标志物，取决于分析准确性和重复性、快捷性，这是确定AMI生物标志物是否具有临床潜力时的关键因素。本研究也存在一些不足之处：①研究纳入的样本量偏少且为单中心研究，在一定程度上对结果造成偏倚。②缺乏对AMI发病过程中miR-210水平的波动变化观察。将急性胸痛发作6 h以内的病人纳入研究对象，基于心肌缺血早期阶段(6 h)，miR水平增高。而对于发病6 h以后的病人没有进一步检测miR-210。而作为经典诊断指标血清cTnT通常在3～6 h开始升高，发病后3～4 d和11～14 d恢复至正常水平[14]。因此连续监测血浆miR-210的变化在大多数急性胸痛病人尽快明确AMI诊断是极为必要的，这对于评估miR-210作为AMI诊断标志物是不可或缺的。后续的工作将对AMI病人在不同时间段进行miR-210检测，以期了解miR-210在AMI发病过程中的变化及其预后价值。

综上所述，AMI病人血浆miR-210表达水平明显增高，与cTnT水平呈正相关，可能是早期诊断AMI新的生物标志物，但其潜在价值还有待于更多的研究加以阐明。