组织蛋白酶B对TRAIL诱导胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的作用研究

涂龙霞，查道德，李蓓莉

(淮北职业技术学院医学系，安徽 淮北 235000)

据统计，全世界每年有超过一百万胃癌新发病例，八十万死亡病例[1]，而且胃癌也是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[2]，每年新增胃癌患者和死亡人数占三分之一[3]。胃癌中绝大部分属于胃腺癌，因此对人类的生命造成了严重的威胁。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是一种新型凋亡诱导分子，是Wiley发现的TNF超家族成员，不引起正常细胞凋亡，可选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡。Cat B是一个相对分子质量为40000～45000的半胱氨酸蛋白酶，属于木瓜蛋白酶家族，广泛分布于多种组织细胞的溶酶体中，在多种肿瘤组织中也有明显表达[4-5]。研究表明，当溶酶体内Cat B释放到细胞质后可使Bid表达，导致细胞色素C释放而诱导细胞凋亡，说明Cat B可诱导细胞凋亡的产生[6-7]。本实验中，我们通过观察Cat B在TRAIL诱导胃腺癌SGC-7901细胞凋亡过程中的表达变化，探讨Cat B在TRAIL诱导胃腺癌SGC-7901细胞凋亡过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料人胃癌细胞系SGC-7901购自中科院上海生命科学研究院生物化学于细胞生物学研究所；人重组可溶性TRAIL购自Bioscience公司；MTT试剂和碘化丙啶均购自美国Sigma公司；Cat B特异性抑制剂CA-074(Me)购自美国CALBIOCHEM公司；鼠抗人Cat B单抗购自美国Merck公司，羊抗小鼠二抗购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胃腺癌细胞SGC-7901在含10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养基、37℃、5%CO2的条件下传代培养。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 将胃腺癌SGC-7901细胞接种于96孔板各孔中，调整细胞密度为1×105，分别加入不同浓度的TRAIL(0、20、60、100、150、200μg/L)进行孵育48h，同时设立DMEM对照组。为了提高实验的准确性，每组设3个平行复孔。48h后，细胞中加入新配制的浓度为5g/L的MTT溶液20μL，继续培养4h。吸除上清液，每孔加DMSO溶液150μL，振荡混匀，避光条件下反应10min，在570nm波长处测吸光度值(A)，并计算细胞抑制率，CI(%)=(1-药物组A值/对照组A值)×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率的变化 将胃腺癌SGC-7901细胞接种于96孔板各孔中，调整细胞密度为1×105，每孔加入100μg/L TRAIL和不同浓度Cat B特异性抑制剂CA-074(Me)(0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)，培养48h后收集各孔上清液至流式细胞管中，每孔加1mL预冷的PBS洗涤一次，离心弃上清。同时每孔加750μL PI溶液，室温下避光孵育20min。收集细胞，用流式细胞仪检测。每组实验重复三次。WinMDI 2.9软件分析二倍体峰(subG1)所占的百分率及细胞凋亡率。

1.2.4 Western blot方法检测细胞中Cat B蛋白变化 将胃腺癌SGC-7901细胞接种于96孔板各孔中，调整细胞密度为1×105，每孔加入100μg/L TRAIL和不同浓度Cat B特异性抑制剂CA-074(Me)(0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)，同时设立DMEM对照组。培养48h后收集细胞，预冷PBS洗涤两遍，加入细胞裂解液，放在冰上裂解30min后，40℃、14000r/min离心20min，吸取上清液获得细胞总蛋白。取定量好的细胞总蛋白与2×蛋白电泳上样缓冲液等量混合，放在100℃孵育器中煮沸3min备用。配好分离胶及浓缩胶后，将变性蛋白样品加入上样孔中，保证每泳道上样量相等，SDS-PAGE电泳。取出蛋白凝胶，洗涤后，放在转印缓冲液中浸泡10min，转膜后5%脱脂牛奶/TBST封闭2h后，加入一抗鼠抗人Cat B(1∶1000稀释)、二抗羊抗鼠HRP-IgG(1∶10000稀释)依次反应，用ECL试剂盒进行显影曝光，以β-actin为内参，扫描图像保存。每组实验重复3次。Image J分析各条带灰度值，以各目的蛋白与相应内参条带的灰度值比值进行统计学分析。

1.3 统计学分析应用SPSS22.0统计学软件分析，计量资料数据以“均数±标准差”表示，两组数据比较用t检验，P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRAIL对SGC-7901细胞增殖抑制作用检测结果用不同浓度TRAIL(0、20、60、100、150、200μg/L)作用于SGC-7901细胞后，从表1可以看出，随着TRAIL浓度增大，对细胞抑制率逐渐增强，细胞增殖反应差异有显著性(P<0.05)。其中，TRAIL作用48h有效半抑制浓度(50%，IC50)为100μg/L，因此，后续实验中，TRAIL我们选用浓度100μg/L、48h的作用时间为抑制SGC-7901细胞生长的最适浓度和处理时长。

表1 不同浓度TRAIL诱导SGC-7901细胞48h的A值和细胞抑制率

注： 与对照组相比，*P<0.05；对照组和不同浓度组相比，#P<0.01。

2.2 Cat B特异性抑制剂CA-074(Me)对SGC-7901细胞凋亡率影响作用检测结果细胞凋亡检测结果显示，与对照组比较，经TRAIL处理后的SGC-7901细胞出现明显的细胞凋亡，经TRAIL和CA-074(Me)共同处理后细胞凋亡率下降，且随着CA-074(Me)浓度升高，细胞凋亡率下降更明显(见图1),说明Cat B在TRAIL诱导SGC-7901细胞凋亡过程中有一定调控作用。

图1 流式细胞仪检测100μg/L TRAIL和不同浓度CA-074(Me)诱导SGC-7901细胞48h的凋亡率

注：与对照组相比，**P<0.01;与TRAIL组相比，#P<0.05,##P<0.01。

2.3 Western blot方法检测细胞中Cat B蛋白变化结果结果发现，100μg/L TRAIL作用后细胞中Cat B高表达；相对于TRAIL组，经TRAIL和CA-074(Me)共同处理后，蛋白表达量下降，且随着CA-074(Me)浓度增大，Cat B表达量逐渐下降。数据经统计学分析，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2。

表2 100μg/L TRAIL和不同浓度CA-074(Me)作用SGC-7901细胞后Cat B蛋白表达率

注：与TRAIL+ CA-074(Me) 组相比，*P<0.05;与其他浓度组相比，#P<0.05。

图2 Western blot检测100μg/L TRAIL和不同浓度CA-074(Me)作用SGC-7901细胞Cat B蛋白表达结果

注：1：0 μmol/L；2：0.2 μmol/L；3：0.5 μmol/L；4：1.0 μmol/L；5：2.0 μmol/L；6：4.0 μmol/L

3 讨论

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)又称 Apo2L，在多种正常组织中都广泛表达，且在多种因子如丝裂原、白细胞介素、干扰素及炎症性的细胞毒素等的刺激下可被诱导表达。TRAIL不引起正常细胞凋亡，可选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡， 成为一种具有开发前景的癌症治疗药物，我们在后续的实验中也会继续研究TRAIL的作用机制。

多年来的研究表明，半胱氨酸蛋白酶 Cat B生理情况下约10%酶原被分泌至胞质，病理状态下，大量Cat B释放到胞质或组织间隙并被激活，介导细胞炎性坏死及凋亡的发生[8]，与肿瘤的发生发展密切相关。Cat B不仅可以通过蛋白水解功能发挥促肿瘤作用，还可以通过与其他分子或药物发生相互作用引起一系列信号转导发挥促肿瘤作用[9-10]。晚期癌症患者与健康人相比，Cat B明显呈高表达状态。前期多组研究结果发现，甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌中Cat B表达明显增高[11-12]。Ebert等研究发现，大部分胃腺癌中Cat B高表达[13]。在本实验中我们通过应用Cat B特异性抑制剂CA-074(Me)来研究Cat B在TRAIL诱导胃腺癌SGC-7901细胞凋亡过程中的调控作用。将CA-074(Me)、TRAIL与SGC-7901细胞共同培养，检测细胞增殖、凋亡情况，并测定细胞中Cat B表达情况。根据细胞增殖和细胞凋亡实验结果得出，单独使用TRAIL能使SGC-7901细胞活力下降、细胞凋亡率明显上升。而加入CA-074(Me)和TRAIL的SGC-7901细胞与单独使用TRAIL相比，细胞活力明显上升，细胞凋亡率明显下降，且随着CA-074(Me)浓度增大，细胞凋亡率下降越明显。根据Western blot结果显示，单独使用TRAIL组的Cat B蛋白高表达，而使用CA-074(Me)后细胞中Cat B蛋白的表达有明显减少，且随着CA-074(Me)浓度的增大，蛋白减少越明显，但 2.0μmol/L与4.0 μmol/L之间的减少趋势在缩小。

综上所述，这些数据从不同角度证实了Cat B在TRAIL诱导胃腺癌SGC-7901细胞凋亡过程中具有一定的调节作用，在后续的研究中，我们会进一步探究Cat B在TRAIL诱导胃腺癌细胞凋亡中的具体作用机制，为临床控制和治疗胃腺癌提供一定的理论和实验基础。