茶树MADS-box家族基因AGL9的克隆及表达分析

杨方慧，夏丽飞，孙云南，陈林波*，田易萍，宋维希，梁名志

(1.云南省农业科学院茶叶研究所/云南省茶树种质资源创新与配套栽培技术工程研究中心/茶叶加工与质量安全研究中心，云南 勐海 666201；2.云南省茶学重点实验室，云南 勐海 666201)

【研究意义】花是被子植物特有的繁殖器官，由4轮花器官构成。由内到外依次为雌蕊、雄蕊、花瓣、萼片[1]。植物花器官的形成与发育一直是植物学研究的热点。而茶树开花结果，直接影响茶叶的产量和品质。因此，探究影响及调控茶树花繁殖发育基因具有重要意义。【前人研究进展】随着分子生物学的发展，对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草各类花器官同源异型突变体的研究发现，MADS-box转录因子形成了经典的ABCDE花发育模型，参与花器官发育和生殖分生组织属性决定[2-4]。该模型全面地阐述了参与花器官形态建成中各基因之间的协调关系，萼片发育由A、E类基因调控，花瓣发育由A、B、E类基因共同调控，雄蕊发育由B、C、E类基因共同调控，心皮发育由C、E类基因调控，胚珠发育由D、E类基因调控[3,5]。在ABCDE花发育模型中，E类功能负责调控四轮花器官的形成[6-7]，是MADS-box转录因子中重要的一类功能基因。茶树花由花托、花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊组成，属完全花[8]。但是有关茶树花器官的形成和发育相关的研究较少。【本研究切入点】云南省农业科学院茶叶研究所科技人员通过人工杂交获得一株花瓣、雄蕊、雌蕊均发育不正常的特异茶树种质，主要表现为一是花瓣不能正常展开，至花脱落雄蕊群依然紧实不像正常花一样成一丝一丝状，花丝短，且花药发育不完全；二是雌蕊呈畸形，每朵花均有2～4簇发育不完全的雌蕊，每簇雌蕊花柱分裂成较细的2～5裂不等，柱头极小。课题组前期对正常父本花和母本花以及杂交后代不育花的转录组差异分析[9-10]，筛选出一条与AGL9基因高度同源的基因序列，通过设计特异引物进行验证，获得含有完整编码的AGL9基因CDS序列。【拟解决的关键问题】对AGL9基因的基本生物信息学特征进行分析，并检测AGL9基因在正常花和不育花中的表达规律，探讨其可能是调控茶树花繁殖发育的重要因素，为深入研究茶树花不育机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用云南省农业科学院茶叶研究所试验基地的云抗10号茶树芽、叶、茎、幼果、花芽、花蕾、含苞待放花、花瓣、雄蕊、雌蕊，以及不育茶树花芽、花蕾、含苞待放花、花瓣、雄蕊、雌蕊为材料。

1.2 总RNA的提取及cDNA的合成

上述样品总RNA的提取选用美国Invitrogen公司的Trizol试剂盒。RNA的浓度检测采用微量分光光度计Nanodrop 2000、完整性分析采用1 %的琼脂糖凝胶电泳。用于基因验证的cDNA采用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒。用于实时荧光定量PCR分析的cDNA采用RevertAid Premium Reverse Transcriptase合成试剂盒。

1.3 CsAGL9基因CDS片段验证

根据CsAGL9基因CDS序列，利用primer premier 5.0软件设计2对特异引物(表1)进行CsAGL9基因的扩增验证。CsAGL9基因的测序分析由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 CsAGL9基因序列的生物信息学分析

利用网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的Blastp和网站http://smart.embl.de/的SMART进行CsAGL9蛋白比对和结构分析；利用BioXM2.6软件分析CsAGL9蛋白的氨基酸组成、多重序列比较以及同源性分析；通过网站http://web.expasy.org/compute_pi/的 ExPASy工具分析CsAGL9蛋白的等电点和分子量；以及运用软件SOPMA预测CsAGL9蛋白的二级结构。

1.5 qRT-PCR分析CsAGL9基因组织特异性表达

根据验证后的CsAGL9基因序列，利用primer premier 5.0软件设计荧光定量PCR引物(表1)。以茶树GAPDH基因(GE651107.1)为内参，利用BBI的SG Fast qPCR aster Mix定量PCR试剂盒以及采用德国LightCycler 480荧光定量PCR仪进行PCR反应。反应程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃ 7 s，57 ℃ 10s，72 ℃ 15 s，共45个循环；72 ℃延伸15 s。设实验重复3个，基因相对表达量采用2-ΔΔCt计算法。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 CsAGL9基因CDS验证和序列分析

前期利用数字表达谱技术筛选出一条与MADS-box家族的AGL9转录因子高度同源的基因序列[9]，该基因在正常花父本花和母本花以及杂交后代不育花中差异表达，其碱基序列为1902 bp，通过NCBI中Blastx比对显示与其他植物的AGL9蛋白同源性高，且含完整的开放阅读框(ORF)。设计2对特征引物进行全长CDS扩增验证，经过高保真酶扩增(图1)，PCR扩增产物回收测序拼接后获得含有726 bp的ORF片段，编码242个氨基酸(图2)，命名为CsAGL9。

2.2 CsAGL9基因的生物信息学分析

通过NCBI和在线软件SMART分析CsAGL9基因氨基酸的保守结构域，结果发现，该蛋白含有2个保守功能结构域，包括MADS盒子和K盒子，属于MADS-box家族的E类功能基因(图3)，说明茶树CsAGL9具有其功能。利用在线工具ExPASy预测蛋白的二级结构进行预测，其中α螺旋为51.24 %，无规则卷曲为35.12 %，延伸链为9.09 %，β-转角为4.55 %。通过CsAGL9的氨基酸同源序列比对，发现与黄瓜(Cucumissativus，登录号为XP_004140534.1)、橡胶树(Heveabrasiliensis，登录号为XP_021644266.1)和可可(Theobromacacao，登录号为XP_007043947.1)的AGL9相似性为91 %，与马铃薯(Solanumtuberosum，登录号为XP_006352168.1)的相似性为90 %(图4)。

M为DL10 000 marker; 1，2为扩增的中间片段M is DL10 000 marker; 1 and 2 are the amplified intermediate fragments图1 CsAGL9基因CDS验证扩增产物Fig.1 CDS validation products of CsAGL9 gene

CsAGL9蛋白质的相对分子量为27.67 kD，等电点为8.96，为碱性蛋白质。利用在线工具SOPMA 对CsAGL9

图2 CsAGL9 CDS与推导的氨基酸序列Fig.2 CDS sequences of CsAGL9 and their deduced amino acids

图3 CsAGL9蛋白功能性位点分析Fig.3 Functional site analysis of CsAGL9 protein

图4 CsAGL9与其他AGL9基因的氨基酸比对Fig.4 Comparison of amino acid sequences of CsAGL9 with other reported AGL9 proteins

2.3 茶树CsAGL9基因的表达特征分析

采用qRT-PCR技术，分析茶树CsAGL9基因在正常花和不育花的花瓣、雄蕊、雌蕊中的表达特征发现，CsAGL9基因在不育花的花瓣和雄蕊中的表达量分别高于正常花的2.75和4.41倍(图5)，而在雌蕊中不育花低于正常花，是正常花的0.8倍。这些结果说明了CsAGL9基因在不育花瓣、雄蕊、雌蕊形成中发挥重要的作用。同时还发现CsAGL9在茎中表达量最高，在叶片和果中表达量最低(图6)，说明CsAGL9的表达具有组织特异性。

3 讨 论

MADS-box基因是广泛存在于动物、植物和真菌中的一类编码转录因子的基因家族，其编码的转录因子在决定植物花器官的形成和发育等方面发挥着重要的作用[11-14]。目前有关MADS-box基因与花器官发育之间的关系研究最为清楚，即著名的花发育相关ABCDE模型[3,15]。花是茶树繁育后代的重要生殖器官，花器官的正常发育是茶树繁衍的重要条件[8]。另外，茶树是一种重要的叶用经济作物，据报道茶树在开花结实期间将消耗大量的营养物质，导致茶树鲜叶产量减少和品质降低[9]。因此，开展茶树花发育机制的相关研究具有提高茶叶价值的重要理论意义和实践意义栽培茶树的主要目的是获得繁茂的芽叶，本研究利用课题组前期获得的1条与AGL9基因高度同源的基因序列[9]，验证克隆了1个含有完整编码的茶树AGL9基因，该基因含有1个726 bp的开放阅读框，编码242个氨基酸，与多种植物AGL9蛋白具有较高的相似性，并且含有MADS盒子和K盒子2个保守功能结构域，属于MADS-box家族的E类功能基因。E功能基因与API/FUL基因一样，仅存在于被子植物中，包含SEP 1/2/3/4(SEPALLATA1/2/3/4)(曾命名AGL2，4，9和3)，是花器官发育的关键因子[15-16]。E类转录因子通过与ABC类蛋白形成四聚体复合物来调控和诱导花器官的形成。拟南芥中AP1-AP3-PI-SEP四聚体复合物决定花瓣的形成，AP3-PI-AG-SEP决定雄蕊的形成，AG-AG-SEP-SEP决定心皮的形成[3,15]，这些蛋白质复合物通过激活或抑制不同的花器官特征基因发挥功能[17-19]。SEP蛋白可作为高级复合物的“粘合剂”，在四因子模型中发挥着必不可少的中心作用[20-23]。本研究结果表明，CsAGL9基因的表达量在茶树正常花和不育花的花瓣、雄蕊、雌蕊中均出现差异性，有可能是导致茶树花不育的一项重要原因。说明以MADS-box为基础的花发育模型基因在茶树花中差异表达，对决定茶树花不育机制方面具有重要作用，直接影响茶树花的生理及发育。下一步将开展CsAGL9功能验证，进一步解析该基因在茶树花器官形成和发育中的功能和作用机制。

图5 CsAGL9在花不同组织中的表达特征Fig.5 The expressions of CsAGL9 in different tissues of flowers

图6 CsAGL9组织特异性表达模式Fig.6 The tissue specific expression pattern of CsAGL9

4 结 论

茶树CsAGL9基因对花瓣、雄蕊、雌蕊等花器官的形成和发育扮演重要的作用。