链霉菌JD211所产活性物质对采后柑橘贮藏保鲜的影响

傅雁辉，赵泽文，徐佳明，李赛英，刘 冲，魏赛金

(江西农业大学 生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室/江西农业大学应用微生物研究所/江西省果蔬采后处理关键技术及质量安全协同创新中心, 江西 南昌 330045)

【研究意义】柑橘果实营养和药用价值较高，但采后柑橘易受青绿霉侵染腐烂，不易久藏保鲜，每年都有大量的柑橘在贮藏和运输过程中腐烂变质，造成了严重的经济损失，青绿霉病、炭疽病、酸腐病等病原菌的侵染是使其发生腐烂变质的主要原因之一[1-2]。当前国内外防治柑橘果实采后生理病害主要采取控制温度、热处理、保鲜剂处理、气调贮藏、涂膜处理、臭氧处理等技术手段，在生产实践中发挥了重要作用[3-4]。采后柑橘主要病害是由真菌引起的，柑橘采后控制病害主要措施是使用化学杀菌剂，如咯菌腈、邻苯基苯酚钠、赛苯咪唑、噻菌灵、抑霉唑和嘧霉胺等，而这些化学杀菌剂因持续使用易产生耐药性，正逐渐被禁止或被限制使用[5]。因此研究开发出化学杀菌剂的替代物来防治果蔬采后病害，是果蔬采后面临的一项紧迫任务。利用拮抗微生物及其发酵活性物质来防治果蔬采后病害，开发成天然防腐剂，减少食品中农药残留、保护环境、确保人体健康等，都具有深刻的意义[6]。【前人研究进展】目前应用于采后柑橘病害生物防治的微生物主要有细菌[7-9]、酵母菌[10-11]、类酵母菌[12]和木霉[13]等。放线菌因能产生多种拮抗物质而成为生物防治领域的一类重要微生物，并且已有多种抗生素广泛应用到果蔬病害控制中。申光辉等[14]研究获得的链霉菌T3-5菌无菌发酵液对草莓采后灰霉病菌具有较强拮抗作用外，且对草莓果实品质具有较好的维持作用，能够延缓果实硬度降低，延缓可溶性固形物、可滴定酸消耗和VC成分的损失。鹿连明等[15]筛选出1株米修链霉菌A3202其发酵产物对柑橘青、绿霉病和柑橘炭疽病相对防效可达100 %。张坤宇等[16]筛选出淡紫灰链霉菌X33对柑橘绿霉病有很强的抑制效果。【本研究切入点】江西省农业微生物资源开发与利用实验室从珙桐植株中分离得到一株产灰褐色孢子的链霉菌，命名为JD211，对菌株JD211进行形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定其为奈良链霉菌(Streptomycesnaraensis)。该菌株所产的环己酰亚胺类活性物质对水稻稻瘟病菌、纹枯病菌、烟草黑胫病菌、意大利青霉等植物病原菌有强烈的抑制作用[17]。本研究以链霉菌JD211固体菌剂发酵活性粗提物为材料，涂膜处理采后柑橘并自然贮藏，通过测定柑橘果实品质、过敏性反应和病程相关蛋白，研究链霉菌JD211活性物质涂膜对采后柑橘的影响，旨在为开发新型绿色无公害的果蔬类防腐保鲜剂提供实践和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘采自江西九江市农民载种柑橘树(未打农药)，其品种为蜜桔，树龄27年，果实八至九成熟。链霉菌JD211(StreptomycesJD211)由江西农业大学应用微生物研究室提供。试剂(分析纯)均为市售试剂。

米饭固体培养基：早米500 g，葡萄糖5 g，麦片20 g。

马铃薯蔗糖固体培养基(PDA)：去皮马铃薯200 g/L，蔗糖20 g/L，琼脂20 g/L。

1.2 仪器与设备

JW-3022HR型高速冷冻离心机，安徽嘉文仪器装备有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；LRH-250A生化培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；SW-CJ-ID型无菌超净工作台，苏州净化设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；721可见分光光度计，上海佑科仪表有限公司；UV759紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；HH恒温水浴锅，江苏金坛市中大仪器厂；手持折光仪，江西赣仪科技有限公司；游标卡尺，上海一尺业有限公司。

1.3 链霉菌JD211活性物质的粗提物制备

先将试管斜面中的JD211接种到茄形瓶中扩大培养，30 ℃培养6～7 d，再将新鲜的早米用清水洗净，加水浸泡24 h，沥干水蒸煮40 min，将葡萄糖用少量蒸馏水溶解加入到米饭中，并加入麦片，搅拌均匀，加水至米饭手捏成团，落地而散。配置好的固体培养基分装到蘑菇瓶中，高温高压灭菌2 h。再将茄形瓶中的JD211孢子用100 mL无菌水洗下，接种到固体培养基中培养，每瓶接种15 mL孢子悬液，30 ℃培养8 d。取1粒米饭发酵物，置于含意大利青霉、指状青霉培养皿中，30 ℃培养3 d，检测活性。用蒸馏水以体积比1∶1浸提培养8 d的固体培养基24 h，离心取上清液，真空抽滤浓缩，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌得到用那他霉素标定的抑菌活性为7.98 μg/mL的无菌JD211活性粗提物。

1.4 果实处理

采摘选取没有机械损伤、大小均匀的果实放入塑料果筐中，静置过夜。先用2 %次氯酸消毒清洗，再用蒸馏水清洗自然晾干，最后用无菌脱脂棉吸取5 mL链霉菌JD211活性物涂膜处理果实，蒸馏水为对照，每种处理150个果实，重复3次[18]。晾干后用聚乙烯薄膜单果包装，放入塑料果框中，置于室内自然贮藏。统计60 d后失重率和烂果率，每隔10 d取样测定果实品质及抗性生理生化指标。

1.5 各项指标测定方法

1.5.1 失重率和腐烂率的测定

失重率=(果实前一次称重-果实后一次称重)/果实前一次称重×100 %

腐烂率=腐烂个数/果实总数×100 %

1.5.2 果实品质测定 可溶性固形物(SSC)含量用手持折光仪测定[19]；可滴定酸(TA)测定参考Henriod[20]；抗坏血酸(AsA)含量采用 2，6-二氯靛酚滴定法测定[21]；蒽酮比色法[22]测定总糖(TSC)含量。

1.5.3 链霉菌JD211对果实过敏性反应的影响 过氧化氢酶(CAT)测定参照隋丽(2009)[23]；脂氧合酶(LOX)活性测定参照李强(2008)[24]；过氧化氢(H2O2)含量采用二甲酚橙法测定[25]；硫代巴比妥酸(TBA)比色法[26]测定丙二醛(MDA)含量。

1.5.4 链霉菌JD211对果实病程相关蛋白的影响 几丁质酶(CHT)活性测定参照Mauch[27-28]的方法，β-1,3-葡聚糖酶(GUN)活性测定参照曹健康的方法[29-30]。

1.5.5 数据分析及图形制作 采用DPS 7.05软件对试验数据进行统计分析，显著水平取P=0.05(差异显著)或P=0.01(差异极显著)。采用Excel 2016和Origin 9.0软件进行数据处理及图形的制作。

2 结果与分析

2.1 链霉菌JD211对意大利青霉和指状青霉抑菌活性

如图1所示，链霉菌JD211固体发酵物对意大利青霉和指状青霉有较强的抑制效果，对意大利青霉拮抗圈平均直径为20.02 mm，对指状青霉拮抗圈平均直径为25.95 mm。

2.2 贮藏效果

腐烂率和失重率是评价一种保鲜剂保鲜防腐效果的重要指标。从表1可看出，链霉菌JD211活性物质涂膜处理的果实失重率为5.62 %，与对照相比涂膜处理能有效减少采后柑橘水分散失程度，其原因可能是由于链霉菌JD211活性物附于柑橘果皮，阻塞了果皮表面气孔，从而减少水分散失。处理组涂膜处理果实腐烂率为10.00 %，极显著低于对照(P<0.01)，这与链霉菌JD211活性物本身具有抑菌作用密切相关，在采后贮藏期间能减少病菌的侵染及病害的发生。

表1 采后柑橘不同处理自然贮藏第60天的失重率和腐烂率

Table 1 Weight loss and decay rate of postharvest citrus treated with different treatments during the 60th day of natural storage

处理失重率( %)腐烂率( %)对照6.02±0.31Aa15.33±0.77AaJD211涂膜5.62±0.39Aa10.00±0.77Bb

注：同一列不同大写字母表示极显著差异(P<0.01)，不同小写字母表示显著差异(P<0.05)。

Notes:Different capital letters within the same colμmn indicate significant difference atP<0.01, Different small letters within the same colμmn indicate significant difference atP<0.05.

2.3 链霉菌JD211对果实品质的影响

果实在采后贮藏过程中，可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸和总糖等物质会随着时间积累和消耗，它们含量的积累和消耗会影响果实的品质。因此这些指标被视为果实品质的重要指标。如图2所示，可溶性固形物(SSC)含量在前期是一个积累的过程，JD211处理在第20天达到峰值，对照组在第10天达到峰值，分别为 9.30 %和8.06 %。JD211处理在第20天后开始急剧下降，并在贮藏后期第30天后趋于稳定；对照组第20天急剧下降至最低值8.06 %，并在30 d后逐渐趋于稳定。贮藏30～60 d期间处理组含量均高于对照组，说明链霉菌JD211活性物质涂膜处理柑橘果实能够减缓果实营养物质的降解速率，延迟衰老进程，从而维持较好的风味。果实抗坏血酸含量先升后降低，处理组和对照组分别在第40和20天达到峰值，每100 g果肉中含量分别为23.00和22.05 mg。处理后期处理组含量高于对照组含量。说明链霉菌JD211活性物质能有效减小果实中抗坏血酸的氧化分解，从而维持果实较高的营养。果实可滴定酸(TA)含量变化处理组和对照组都是先上升后下降，0～10 d可滴定酸含量积累达到峰值，分别为0.69 %和0.73 %，第10天至末期可滴定酸含量逐渐下降至最低值，贮藏第60天时可滴定酸含量处理组比对照组高41.41 %，处理组的下降程度较对照组平缓，含量比对照组高，二者差异显著(P<0.05)。说明JD211活性物处理果实能够减缓果实中可滴定酸的分解速率，有效保持果实的风味品质。果实总糖(TSC)含量变化均呈平缓波动，对照组果实的波动较处理组平缓，处理组果实总糖含量在0～60 d内产生两次波峰，在贮藏第50天两处理达到峰值其中处理组较对照组高6.46 %，0～50 d内处理组总糖含量高于对照组，说明链霉菌JD211活性物处理能有效减少采后贮藏过程中对糖类的消耗，维持果实品质。

图1 链霉菌JD211对意大利青霉(A)和指状青霉抑菌(B)效果Fig.1 Inhibitory effect of Streptomyces JD211 on P. Italialis(A) and P. digitatum(B)

图2 链霉菌JD211发酵提取物对果实品质的影响Fig.2 Effect of fermentation extracts of Streptomyces sp. JD211 on fruit quality

2.4 链霉菌JD211对果实过敏性反应的影响

如图3所示，果实H2O2含量变化在贮藏10 d内均是迅速下降，对照组在第10天后H2O2含量积累逐渐上升并在第60天达到最大值46.58 μmol/g，处理组在第10天后逐渐上升并在第40天后下降至末期达到最低值9.02 μmol/g。贮藏第10天后对照组H2O2含量均高于处理组，二者差异显著(P<0.05)。说明链霉菌JD211活性物涂膜处理果实，能有效降低果实膜系统的损害，维持植物体较强的保护性能。果实过氧化氢酶(CAT)活性变化趋势都是逐渐波动上升，对照组和处理组CAT活性在第50天均达到峰值，其中处理组比对照组活性高22.73 %，贮藏前期对照组CAT活性高于处理组，中后期处理组CAT活性均大于对照组，二者差异显著(P<0.05)。说明了链霉菌JD211活性物涂膜处理柑橘果实增强了CAT活性，提高了H2O2的分解能力，减缓了H2O2的影响。果实丙二醛(MDA)含量变化趋势对照组是逐渐上升，并在第60天达到最大值0.25 mmol/g，处理组MDA含量变化先上升后趋于平缓，在第20天达到最大值0.89 mmol/g，对照组MDA含量在贮藏后期高于处理组，贮藏第60天对照组含量比处理组高56.84 %，二者差异显著(P<0.05)。可见链霉菌JD211活性物涂膜处理可以抑制MDA含量的积累，减少膜脂过氧化程度，维持膜系统的完整性，从而对逆境有较好的抗性。果实脂氧合酶(LOX)活性对照组变化趋势是先上升后趋于平缓，在第20天达到峰值。链霉菌JD211活性物涂膜处理LOX活性呈下降变化，第60天对照组LOX活性较处理组高 62.34 %， 贮藏期间LOX活性处理组低于对照组，可见链霉菌JD211活性物涂膜处理降低了LOX活性，减缓果实膜脂过氧化。

2.5 链霉菌JD211对果实病程相关蛋白的影响

如图4所示，果实β-1,3-葡聚糖酶(GUN)活性呈单峰变化。对照组和处理组GUN活性在贮藏前期均快速上升至峰值，随后迅速下降。其中第20天处理组GUN活性较对照组高53.35 %，贮藏10～50 d期间处理组酶活性显著(P<0.05)高于对照组，可见链霉菌JD211活性物涂膜处理，增强了GUN活性，提高了果实抗病性。果实几丁质酶(CHT)活性变化表现为先上升后下降对照组的峰值出现在第20天为0.0314 U/g FW，涂膜处理峰值出现在第30天为0.0283 U/g FW。涂膜处理的峰值低于对照组，其上升和下降的幅度均小于对照组，贮藏第30天后，处理组CHT活性均大于对照组，第60天处理组较对照组高94.28 %，可见涂膜处理可以减缓果实贮藏过程中的CHT活性的波动，增强抗病性。

图3 链霉菌JD211对果实过敏性反应的影响Fig.3 Effect of streptomyces JD211 on allergic reaction of fruits

图4 链霉菌JD211对果实病程相关蛋白的影响Fig.4 Effect of Streptomyces JD211 on Pathogenesis-related protein in fruit

3 讨 论

本研究发现采用链霉菌JD211固体发酵提取物涂膜处理采后柑橘，自然贮藏条件下，能有效减少采后柑橘果实失重率和腐烂率，减缓可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸和总糖的损耗、变化，贮藏后期对可滴定酸损耗有明显减缓效果，维持了果实的品质。这与申光辉等[14]对草莓防腐保鲜结果类似。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的重要产物之一，其含量的多少可以反应出植物的抗逆性和膜系统受损伤程度，随着贮藏时间的增加，果实逐渐衰老，MDA含量也会逐渐上升。脂氧合酶(LOX)是广泛存在于植物体中的与膜脂过氧化过程有关的酶，其活性的增加可能会加速细胞膜脂过氧化，促进果实衰老[31]。链霉菌JD211活性物涂膜处理柑橘果实能有效的减少贮藏期间MDA的积累，延缓LOX活性高峰的出现，处理组LOX活性直到第50天才达到峰值，说明JD211涂膜处理延缓了细胞膜脂过氧化程度，从而有效减缓了柑橘果实发病程度和时间。H2O2是生物体内各种生理代谢的副产物，是一种氧化胁迫因子，植物组织遭受各种非生物及生物胁迫时，它的含量迅速升高，过量H2O2会对细胞产生毒害作用[32]。过氧化氢酶(CAT)通过清除植物组织细胞内H2O2，增强抗氧化能力。植物在受到病原菌侵染后，通过与病原菌相互作用诱导防卫基因的活化，合成抗菌物质及防御蛋白，β-1,3-葡聚糖酶(GUN)和几丁质酶(CHT)都属于这类蛋白。CHT和GUN主要降解几丁质和葡聚糖，这两种物质都是病原菌细胞壁的主要成分[33]。本研究发现链霉菌JD211活性物涂膜处理延缓了GUN和CHT活性的峰值和活性，提高和延长了病程相关蛋白酶活性，增强了果实的抗病性。

4 结 论

链霉菌JD211固体发酵活性物不仅对柑橘病原真菌意大利青霉和指状青霉有强烈的拮抗作用，同时涂膜处理采后柑橘，对采后柑橘自然贮藏果实品质维持、果实过敏性和抗病性有较好的效果，具有开发成采后柑橘保鲜剂的潜力。