发酵型牡蛎调味液的研制及其营养价值研究

白 洁

(西华大学，成都 610039)

牡蛎(Oyster)属软体动物门、瓣鳃纲、异柱目、牡蛎科动物，是一种药食同源、营养价值丰富的水产品，素有“海中牛奶”之称[1]。其中，太平洋牡蛎(Crassostreagigas)的产量约占总牡蛎产量的1/3，其蛋白质、必需氨基酸含量高，口味鲜美，具有较高的利用价值[2]。

随着生物科学技术的发展和人们生活水平的提高，高值化水产品的需求量大幅上升，水解蛋白产品则为其中最受欢迎的一种。蛋白质被水解后变成小分子肽，营养价值变高，功能性质也有所提升，被越来越多的研究者所青睐。豆类蛋白质、鱼肉蛋白质水解产物均得到广泛的研究，也有新的功效被发掘出来，如降血压、降血糖、增强免疫力[3,4]。而牡蛎水解蛋白的研究则较为少见[5,6]。目前蛋白质水解的方法是加入商业用酶，例如木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶，而酶的成本较高，这对实际生产造成了一定影响，我们考虑用微生物发酵牡蛎来制备牡蛎水解蛋白，发酵液营养价值高，可用来制备新型调味液，丰富牡蛎的产品结构。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜太平洋牡蛎：购自成都市某水产品批发市场，于2 h内低温运输至实验室；干酪乳杆菌(L．casei)：编号GIM1.190，购于CICC；MRS培养基：英国Oxoid公司；其他化学试剂：均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

MJ-PB80Easy210型破壁机 广东美的生活电器制造有限公司；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 美国Eppendorf公司；2300 自动凯氏定氮仪 瑞士FOSS 公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；PHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；桑普特电气两用杀菌锅 诸城市金鼎食品机械有限公司。

1.3 牡蛎匀浆液培养基的制备

将牡蛎清洗干净，取牡蛎肉，称重，加入同样质量的蒸馏水，放进破壁机中匀浆2 min。测定匀浆液的蛋白质含量[7]，加入5%(质量比)蔗糖，用质量分数为0.1%的活性炭脱腥脱色30 min，用蒸馏水稀释至蛋白质含量为10%(质量比)，并且调节pH至7.0，置于500 mL锥形瓶中，于105 ℃灭菌20 min，冷却，备用。

1.4 干酪乳杆菌发酵

将用MRS培养基活化过的干酪乳杆菌再次接种至MRS培养基，培养48 h，制成种子液，该种子液的浓度为106CFU/mL。将种子液接种到1.3方法制备的牡蛎匀浆液培养基中，接种量为8%，装液量为30%，150 r/min的速度，在36 ℃的温度下振荡培养，在不同时间(0，1，2，3，4，5 d)取样，在95 ℃水浴中煮沸15 min以灭酶，8000 r/min离心15 min，取上清液，则为牡蛎发酵液。

1.5 蛋白质回收率的测定

以GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》为参考，测定牡蛎匀浆液培养基和牡蛎发酵液的蛋白质含量，用下式计算蛋白质回收率。

1.6 牛磺酸含量的测定[8]

参照GB/T 5009.169-2003中的高效液相色谱法进行测定。

1.7 氨基酸态氮含量的测定[9]

采用甲醛电位滴定法。

1.8 挥发性盐基氮(TVBN)的测定

采用康卫氏皿扩散法。

1.9 氨基酸组成的测定[10]

称取一定量牡蛎匀浆液培养基、牡蛎发酵液，加入6 mol/L HCl(含有1%苯酚)，在105 ℃水解24 h，定容，成水解液。吸取20 mL上述水解液真空干燥，样品衍生，再次进行干燥。将样品稀释液与干燥样品混合溶解，以8000 r/min的转速、4 ℃的温度离心15 min，高效液相分析。色谱柱：PICO-TAG柱，长度150 mm；流动相A：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 6.5)；流动相B：60%乙腈溶液；检测波长254 nm；流速1.0 mL/min。

1.10 牡蛎发酵调味液的制备及感官评价

按照1.4方法制备好的牡蛎发酵液加入0.1%(W/V)的高甲氧基果胶作为稳定剂，再加入0.2%(W/V)的甜味剂，灌装，冷却，制备成牡蛎发酵调味液。在4 ℃静置24 h后对牡蛎发酵调味液进行感官评价。

1.11 牡蛎发酵调味液体外ACE抑制活性测定[11]

采用HPLC法测定体外ACE抑制活性，将50 μL牡蛎发酵调味液与等量ACE酶液(25 mU)混合，加入80 μL浓度为2.5 mmol/L的马尿酸-组氨酰-亮氨酸-硼酸缓冲液，在37 ℃反应60 min，加入250 μL 1 mol/L的HCl将反应终止，过膜，HPLC进样。

色谱条件：色谱柱ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为超纯水(0.08% TFA)；流动相B为100%乙腈(0.08% TFA)；柱温：25 ℃；流速：0.5 mL/min；进样量：50 μL；检测波长：228 nm。

1.12 数据分析

将实验数据用SPSS 19.0、Origin 8.1进行分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质回收率

测定不同发酵时间牡蛎发酵液的蛋白质回收率，结果见图1。

图1 蛋白质回收率和牛磺酸含量随发酵时间的变化

发酵时间对蛋白质回收率的影响比较大，随着发酵时间的延长，蛋白质回收率先急剧增加后缓慢增加，从第0天时的44.7%增加到第5天时的91.5%，实际上，第4天时的蛋白质回收率为88.3%，已接近第5天的最大值，二者无显著性差异(p>0.05)。接种的干酪乳杆菌能够很好地利用蛋白质，可将不溶性大分子蛋白有效降解成可溶性小分子蛋白，故可增大蛋白质回收率[12]。较高的蛋白质回收率证明用干酪乳杆菌发酵牡蛎匀浆液来制备牡蛎水解液，进而制备牡蛎发酵调味液的可行性。

2.2 牛磺酸含量

牡蛎营养价值的一个独特之处在于它的牛磺酸含量极高，测定不同发酵时间牡蛎发酵液的牛磺酸含量，结果见图1。未发酵的牡蛎匀浆液牛磺酸含量为480 mg/dL，随着发酵时间的延长，牛磺酸含量先大幅增加后趋于平稳，最高达到586 mg/dL。发酵过程并没有使牛磺酸含量降低，反而升高了其含量，这可能归功于干酪乳杆菌所产生的各种酶的作用。

2.3 氨基酸态氮含量

测定不同发酵时间牡蛎发酵液的氨基酸态氮含量，结果见图2。

图2 氨基酸态氮含量和TVBN随发酵时间的变化

随着发酵时间的延长，氨基酸态氮含量明显增加，在发酵后期达到平稳，在第5天时达到0.98 mg/100 g。牡蛎中的蛋白质含量较高，在干酪乳杆菌的作用下，大分子蛋白质被分解为小分子肽或游离氨基酸，发酵时间越长，干酪乳杆菌产生的蛋白酶越多，被酶分解出的游离氨基酸越多，故氨基酸态氮含量也越多，这有助于肠道对蛋白质的消化吸收，牡蛎发酵液营养价值大幅提高[13]。

2.4 TVBN

牡蛎作为一种滤食性海洋生物，身上有很多微生物，这些微生物会引起牡蛎品质变化。挥发性盐基氮(TVBN)是由于酶和细菌的作用，使蛋白质分解产生氨、三甲胺、甲胺等碱性含氮物质，会使牡蛎腐败。由图2还可知，未发酵的牡蛎匀浆液的TVBN含量较低，为37.7 mg/100 g，而经过发酵的牡蛎发酵液的TVBN含量有所上升，尤其在第5天明显上升。TVBN含量的上升是因为加入的干酪乳杆菌所致，其使大分子蛋白质分解，产生很多游离氨基态氮，这其中就有氨、三甲胺、甲胺等物质，发酵时间越长，这些物质累积越多。鉴于TVBN含量过高对感官、品质等方面均会产生不良影响，制作牡蛎发酵调味液时，发酵时间不宜过长，要综合考虑。

2.5 氨基酸组成

测定不同发酵时间牡蛎发酵液的氨基酸含量，结果见表1。

表1 氨基酸含量随发酵时间的变化

由表1可知，牡蛎发酵液的氨基酸组成非常完善，必需氨基酸含量高，所占比例在42.7%～43.1%之间，具有较高的营养价值。并且婴儿必需的精氨酸含量也相当高，所占比例在22.1%～23.6%之间，符合婴儿的营养需求。总氨基酸含量由第0天的91.46 mg/dL上升到第4天的最高值97.89 mg/dL，而第5天含量有所下降，为97.45 mg/dL。在所测试的17种氨基酸中，除了组氨酸、丙氨酸外，其余氨基酸没有明显下降，基本都呈上升趋势[14]。干酪乳杆菌发酵牡蛎使牡蛎蛋白质更易被吸收，除此之外，特定的氨基酸还可能起到更多的健康作用，例如抗氧化、抗高血压、抑制ACE、增强免疫力等，起到了营养强化的作用。

2.6 牡蛎发酵调味液感官评价

不同发酵时间制作的牡蛎发酵调味液的感官评分见表2。

表2 牡蛎发酵调味液感官评价

由表2可知，未经发酵(0 d)制作的调味液的总评分较低，有较重的牡蛎腥味，尝起来酸涩，颜色较黄，略有沉淀。随着发酵时间的延长，牡蛎发酵调味液的总评分有很大提高，但是发酵时间过长，评分又略有下降。发酵1，2，3，4 d制作的牡蛎发酵调味液风味独特，有清香的牡蛎味，没有腥味，爽口，酸度适宜，呈象牙白色，组织均匀、无沉淀。发酵5 d制作的牡蛎发酵调味液缺乏牡蛎香味，反而有酸臭味，后味较重，酸味偏重，呈黄色，略有沉淀，这可能是因为发酵过度，较高的TVBN引起轻微腐败，导致感官品质下降[15]。故实际生产中可以采用发酵4 d。

2.7 牡蛎发酵调味液体外ACE抑制活性

测定不同发酵时间牡蛎发酵液制成的牡蛎发酵调味液的体外ACE抑制活性，结果见图3。

图3 ACE抑制能力随发酵时间的变化

未发酵的牡蛎匀浆液本身就具有较高的ACE抑制活性(47.5%)，经过1 d干酪乳杆菌的发酵，牡蛎发酵调味液体外ACE抑制活性急剧增大，然后缓慢增加至平稳，在第5天达到最大值83.6%。可见发酵前后两者的体外ACE抑制活性有显著差异，可能是在干酪乳杆菌所产的蛋白酶等酶类的作用下，蛋白质分解成特定肽段或氨基酸，这些肽段或氨基酸与ACE活性区域亲和力较强，产生竞争性抑制，可能产生降血压的良好效果。有研究表明[16]，含有较高含量的疏水氨基酸(如缬氨酸、异亮氨酸)支链时，ACE抑制活性较强，上述结果表明，发酵后，缬氨酸、异亮氨酸含量有所增加，这可能是牡蛎发酵调味液具有较好体外ACE抑制活性的主要原因。

3 结论

以太平洋牡蛎肉为原料，将干酪乳杆菌接种至牡蛎匀浆液，发酵不同时间，测定了发酵液的蛋白质回收率、牛磺酸含量、氨基酸态氮含量、TVBN含量、氨基酸组成。用发酵液进一步制成牡蛎发酵调味液并进行感官评价，测定了其体外ACE抑制活性。结果表明，随着发酵时间的延长，上述指标均有所增加，其中发酵液的蛋白质回收率高达91.5%，牛磺酸含量最高达到586 mg/dL，氨基酸态氮含量在第5天时达到0.98 mg/100 g，TVBN含量在第5天明显上升，氨基酸含量在第4天时达到最高值97.89 mg/dL，营养价值大幅提高。牡蛎发酵调味液具有较高的感官评分，尤其是发酵4 d的调味液，风味独特，有清香的牡蛎味，没有腥味，爽口，酸度适宜，呈象牙白色，组织均匀，无沉淀。牡蛎发酵调味液还能明显提高体外ACE抑制活性，ACE清除率最高可达83.6%。本研究为牡蛎高值化利用提供了理论依据，为牡蛎产品的开发提供了新的思路。