正交试验优化苦荞黄酮提取工艺

米智，刘荔贞，武晓红，梁艳茹

(1.山西大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学 化学与环境工程学院，山西 大同 037009)

荞麦属于双子叶蓼科类植物[1]，分为普通荞麦和苦荞麦两种。苦荞即苦荞麦，学名鞑靼荞麦，别名荞叶七、野兰荞、万年荞、菠麦、乌麦、花荞等，起源于我国西南部，栽培于我国东北、内蒙古、河北、山西、陕西、甘肃、青海、四川、云南等地。亚洲、欧洲和北美也有栽培[2,3]。苦荞中含有大量的营养物质，包括碳水化合物、葡萄糖、蛋白质、多酚类、植物固醇、维生素、油酸、亚油酸、类胡萝卜素、微量元素和矿物质等。苦荞麦中富含人体必需的8种氨基酸，是粮食中氨基酸含量之首。此外，苦荞中的维生素、矿物质和黄酮类物质也远高于其他作物，由于其富含黄酮类化合物，具有多种生理功能，被誉为“药食同源作物”[4]，也有“五谷之王”的美称[5]。《本草纲目》记载：“苦荞味苦，性平寒，能实肠胃，益气力，续精神，利耳目，炼五脏渣秽”[6]。

与普通荞麦相比，苦荞含有更多的芦丁、槲皮素、山奈酸、芸香糖苷等黄酮类物质[7]，这些具有生物活性成分的苦荞黄酮对人体有抗氧化、清除氧自由基、降血糖、降血脂、改善认知功能、抗高血压和抗动脉粥样硬化等作用，被誉为“三降食品”(降血糖、降血脂和降血压)[8]。同时还具有抑菌、抗病毒、防癌、预防多种慢性疾病等功效，在食品加工中广泛用于各种糕点、调味食品、保健食品等的生产，深受人们的喜爱[9-11]。产于山西的苦荞麦中总黄酮含量显著高于湖南、宁夏、贵州、云南等地的苦荞麦[12]。

目前，关于苦荞黄酮不同部位化合物分离、提纯的研究较多，主要有对苦荞麸皮黄酮的乙醇浸提法和微波提取法[13，14]；也有大孔树脂分离法和酶提取法[15，16]；但对苦荞食用部位麦粒黄酮的提取方法主要有传统的水煎煮法和超临界流体萃取法[17]。本文采取的索氏提取法具有选择性好、能耗低、设备操作简便等优点，适于实验室应用；黄酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇无毒且沸点低，适于索氏提取法进行苦荞麦粒中黄酮的提取，且使用乙醇为提取剂时回收利用方便，乙醇回流法提取的黄酮要比水煎煮高得多，有利于降低生产成本[18]。以苦荞麦粒为研究对象，利用正交试验探究索氏提取法提取苦荞麦粒中黄酮的最佳工艺条件，为苦荞麦粒中黄酮的开发利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山西广灵苦荞：山西省农业科学院高寒作物研究所提供；芦丁标准品：南京奥多福尼生物科技有限公司；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅、酸度计、精密电子天平、真空抽滤装置、数显恒温水浴锅、紫外/可见分光光度计、高速中药粉粹机、索氏提取器等。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的建立

准确称取芦丁标准品10 mg，加少量乙醇，在超声波辅助下，摇匀使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL芦丁标准液[19]。

取6个干燥洁净的25 mL容量瓶，按表1的顺序加入试剂。

表1 芦丁标准曲线的制作

以0号容量瓶为空白对照，在510 nm处用紫外/可见分光光度计测定吸光值，测定3次求平均值，做回归处理。

1.3.2 苦荞处理及黄酮提取工艺流程

选择无发霉、无机械伤、无病虫害、颗粒饱满的苦荞种子，放入电热恒温鼓风干燥箱中，在50 ℃下干燥2 h后，用万能粉碎机粉碎成苦荞粉末，并使苦荞粉通过60目筛，收集苦荞粉末于干燥的容器中待用。

黄酮提取工艺流程：苦荞→清选→烘干→粉碎→过筛→称重→分装小包→乙醇回流浸提→提取液定容→测定吸光值→计算提取率。

1.3.3 苦荞总黄酮的测定方法

精确量取1 mL提取液作为待测液，方法同1.3.1，在510 nm处测吸光值，做3组平行试验求平均值，代入线性回归方程，得到苦荞总黄酮的含量。

式中：C为苦荞总黄酮浓度，mg/mL；N为稀释的倍数；V为提取液总体积，mL；W为样品的质量，g；1000为mg和g之间的转化率。

1.3.4 苦荞总黄酮提取工艺的单因素试验[20]

1.3.4.1 乙醇浓度

准确称取苦荞粉末2 g，在加醇量为苦荞质量的7倍、回流时间为2 h、提取次数为2次的前提下，设置乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%提取苦荞中的总黄酮，并在510 nm处测定提取液的吸光值，计算黄酮提取率。

1.3.4.2 乙醇添加倍数

准确称取苦荞粉末2 g，在乙醇浓度为70%、回流时间为2 h、提取次数为2次的前提下，设置乙醇添加量为苦荞质量的6，7，8，9，10倍提取苦荞中的总黄酮，并在510 nm处测定提取液的吸光值，计算黄酮提取率。

1.3.4.3 提取次数

准确称取苦荞粉末2 g，在乙醇浓度为70%、回流时间为2 h、加醇量为苦荞质量7倍的前提下，设置提取次数为1，2，3，4，5次提取苦荞中的总黄酮，并在510 nm处测定提取液的吸光值，计算黄酮提取率。

1.3.4.4 回流时间

准确称取苦荞粉末2 g，在乙醇浓度为70%、加醇量为苦荞质量的7倍、提取次数为2次的前提下，设置回流时间为1，1.5，2，2.5，3 h提取苦荞中的总黄酮，并在510 nm处测定提取液的吸光值，计算黄酮提取率。

1.3.5 苦荞总黄酮提取工艺的正交试验

准确称取苦荞粉末2 g，参考1.3.4单因素试验结果，在乙醇浓度、加醇量、提取次数和回流时间4个单因素中，分别选出3个对苦荞总黄酮提取率影响最大的水平，做L9(34)正交试验。

1.3.6 苦荞总黄酮提取工艺的验证性试验

为了更好地证实乙醇回流法提取苦荞总黄酮的可靠性和合理性，在正交试验的基础上，进行了3次平行试验，分别计算出该条件下的最佳提取率。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以芦丁浓度(C，m/V)为横坐标，吸光值OD510为纵坐标，制作标准曲线，得出线性回归方程：y=9.167x+0.171，R2=0.991。

2.2 苦荞总黄酮提取工艺的单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对苦荞黄酮提取率的影响

图1 不同乙醇浓度对苦荞黄酮提取率的影响

由图1可知，当乙醇浓度低于70%时，苦荞黄酮提取率随乙醇浓度增大而提高，在乙醇浓度为70%时黄酮提取率达到最大，约为2.84%；当乙醇浓度超过70%后，随着乙醇浓度的提高，黄酮提取率反而降低。因此在做正交试验时，选取乙醇浓度分别为60%、70%、80%作为3个水平。

2.2.2 乙醇添加倍数对苦荞黄酮提取率的影响

图2 乙醇添加倍数对苦荞黄酮提取率的影响

由图2可知，苦荞黄酮提取率随着乙醇添加量的增大而提高，当乙醇添加量是苦荞质量的7倍时，苦荞黄酮提取率达到最大值，约为2.86%；当乙醇添加量超过苦荞质量的7倍时，随着乙醇添加量的增加，黄酮提取率反而降低。因此在做正交试验时，选取乙醇添加量分别为苦荞质量的6，7，8倍作为3个水平。

2.2.3 提取次数对苦荞黄酮提取率的影响

由图3可知，苦荞黄酮提取率随着提取次数的增加而提高，当提取3次时，黄酮提取率达到最高值，约为3.17%，随着抽提次数的增加，苦荞黄酮的提取率反而降低。因此在做正交试验时，选取抽提次数分别为2，3，4次作为3个水平。

图3 提取次数对苦荞黄酮提取率的影响

2.2.4 回流时间对苦荞黄酮提取率的影响

图4 回流时间对苦荞黄酮提取率的影响

由图4可知，当回流时间不足2 h时，苦荞黄酮提取率随着回流时间的延长而提高，且回流2 h时黄酮提取率达到最大值，约为2.95%，随着回流时间的延长，苦荞黄酮提取率反而有所降低。因此在做正交试验时，选取回流时间分别为1.5，2，2.5 h作为3个水平。

2.3 苦荞总黄酮提取工艺的正交试验结果

正交试验设计见表2。

表2 L9(34)正交试验因素水平表

表3 苦荞黄酮提取正交试验结果与分析

续 表

由表3可知，最佳的提取工艺条件为A2B2C3D1，由极差值R的大小可知各因素对本试验方法的影响次序为：C(乙醇浓度)>B(提取次数)>D(回流时间)>A(加醇量)。

由表4可知，在索氏提取法提取苦荞黄酮工艺中，选取的4个因素乙醇浓度、加醇量、回流时间和提取次数对苦荞黄酮提取率的影响均不显著。

2.4 优化条件的验证性试验

根据正交试验结果分析，筛选出苦荞总黄酮提取的最佳工艺，然后进行3组重复试验，对正交试验结果的可靠性和准确性进行验证。测得苦荞黄酮得率，见表5。

由表5可知，3组平行样数据的RSD为0.28%，满足要求，得出该提取工艺条件下苦荞黄酮提取率较为稳定。

3 结论

由正交试验结果及方差分析可知，索氏提取法提取苦荞黄酮的最佳工艺为：乙醇添加量为苦荞质量的7倍，提取3次，乙醇浓度为80%和回流时间为1.5 h。影响程度为：乙醇浓度>提取次数>回流时间>加醇量，4个因素对苦荞黄酮提取率的影响均不显著。由验证性试验可知，该工艺黄酮提取率最高，相对标准偏差(0.28%)较小，试验稳定可靠。为今后研究苦荞中黄酮等成分的提取提供了试验依据。