甘蔗糖厂成糖工段洁净区检出的部分微生物

刘俊菲,林凤,王玉梅,李慧敏,李凯，2，3,毛瑞丰*

(1.广西大学 轻工与食品工程学院，南宁 530000;2.糖业及综合利用教育部工程研究中心，南宁 530000;3.广西蔗糖产业协同创新中心，南宁 530000)

微生物对制糖生产的影响作用历来受到生产者的关注[1]，影响作用包括[2]：微生物的蔗糖转化酶将蔗糖转化，并进一步发酵产生小分子量的乙醇、醋酸、乳酸等，减少蔗糖产出；微生物的代谢改变生产物料的理化性质及流变性，增加工艺处理的难度和资源投入。最典型的例子就是蔗饭问题，即肠膜状明串珠菌的危害[3]。近年来，成品糖酸性絮凝物超标已经成为我国甘蔗制糖业的一大困扰，严重限制了众多企业成品糖质量水平的提高。微生物污染与成品糖酸性絮凝物超标之间的关联已被研究证实[4]。另一个具有普遍性的严重问题是，成品糖中微生物指标超标，许多糖厂成品糖微生物学指标超标，潮包变红现象多发[5]。

为了有效控制微生物对制糖生产的影响，大量的研究工作在以下领域展开：制糖生产病害微生物的分离鉴定；病害微生物的微生物学特性；污染微生物对生产的不良影响；杀菌剂、抑菌剂、消毒剂的研发应用等等。针对微生物危害，甘蔗制糖企业在生产工艺的优化改良、生产过程的强化管理等方面都采取了积极的措施，取得了一定的控制成效[6]。

成糖工序是微生物危害发生的重要关键点，成糖工段洁净区微生物分布状况直接影响成品糖的质量。制糖企业参照其他行业GMP规范要求[7]，将成糖工段进行了洁净区分隔，安装了成糖工段空气处理系统，体现了企业对食品质量与安全的高度重视[8]。但是，成糖工段洁净区的设置并没有达到预期的效果，糖厂普遍发现：成糖工段分隔后，成品糖的微生物总数反而升高，细菌、酵母、霉菌均有增加，潮包变红现象更为严重。

因此，认为关于成糖工段洁净区微生物危害的研究十分不足。突出表现为缺乏系统性、科学性、可操作性的微生物风险评估与危害管理的理论体系用于指导生产实践。成糖工段洁净区微生物分布的研究工作还相当不足，无法掌握该特定区域微生物分布规律，无法展开风险评估。洁净区的划分和设置因为缺乏环境微生物学、微生物风险评估的指导而不具备针对性应用价值。现有的相关规范仅仅是具有卫生学意义的原则性规定，缺乏可评价并指导生产管控的明确指标和操作指令。

本文介绍了2010年以来，本研究团队对糖厂成糖工段洁净区微生物危害分析及控制研究的部分工作，即几家甘蔗糖厂成糖工段洁净区检出的部分微生物。

1 研究方法

1.1 取样方法

环境空气采样、设备表面采样、生产线采样及糖垢采样点采样参考GB 4789.2-2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法；利用AM-4812风速仪和飘带法以及AT 7592指南针测定风速、风向；利用温度计和湿度测定仪对温度进行测定。

1.2 微生物数量检测方法

空气检测样本的取样及计数采用平板暴露法，参见GB/T 16294-2010。

设备及环境表面检测样本取样及计数采用棉拭子法，参见DB34/T 1390-2011。

糖垢、生产线检测样本取样及计数采用平板计数法，参见GB 4789.2-2016。

1.3 微生物鉴定

采用纯培养技术，从计数平板上分离并鉴定菌种。对获得的纯培养进行分子生物学鉴定，16S rRNA、ITS测序，最大似然法(maximum likelihood method，ML)和贝叶斯法(Bayesian method，BI)分别在Paup*4.0b10和MrBayes×64构建系统发育树。部分菌株做了Vitek2 Compact全自动微生物鉴定、MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱分析。

2 研究结果

几个批次的样品现场取样后，从几家糖厂共分离获得细菌372株，酵母16株，霉菌368株，参见文献[9-11]，鉴定出细菌26种(属)，酵母12种(属)，霉菌22种(属)。其中包括致病性及条件致病性微生物18种(属)，致害性微生物5种(属)。

从几家糖厂分离鉴定的细菌见表1，从几家糖厂分离鉴定的酵母见表2，从几家糖厂分离鉴定的霉菌见表3。

表1 从几家糖厂分离鉴定的细菌

表2 从几家糖厂分离鉴定的酵母

表3 从几家糖厂分离鉴定的霉菌

续 表

2.1 检出率较高的微生物

细菌中的芽孢杆菌属、微球菌属，霉菌中的曲霉属、青霉属是检出率较高的种类。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)、纠结青霉(Penicilliumimplicatum)、构巢裸胞壳菌(Emericellanidulanss)以及谢瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)是分布最为广泛的微生物，从空气样本、生产线样本、糖垢样本、表面样本中均有检出。

2.2 检出的致病性及致害性微生物

致病性和条件致病性微生物是指已知对人体有致病性或条件致病性的微生物。从几家糖厂分离鉴定的致病性微生物见表4。致害性微生物是指对制糖过程及成品品质产生危害的微生物，如产生色素。从几家糖厂分离鉴定的致害性微生物见表5。

表4 从几家糖厂分离鉴定的致病性微生物

表5 从几家糖厂分离鉴定的致害性微生物

2.2.1 黄曲霉

黄曲霉(Aspergillusflavus)，半知菌类，一种常见腐生真菌，其结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色，菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。其菌毒素中毒性最大，包括致毒性、致癌性、致突变，对人类健康危害最为突出。

黄曲霉的次级代谢产物是黄曲霉毒素(AFs)，它具有高毒性且分子质量较低，常见于粮食作物(花生、水稻、玉米等)及乳制品等食品中。黄曲霉毒素主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)。其中生活型最强的是黄曲霉毒素B1且最常见，分布广，被公认为毒物之首和I级强致癌物[12]。

2.2.2 桔青霉

桔青霉(Penicilliumcitrinum)是一种真菌毒素，菌丝是由有隔多核的多细胞构成。常见于腐烂的水果、蔬菜、发霉饲料、粮食、肉类和含红曲添加剂的食品中，桔青霉的毒性主要包括：肾脏毒性、肝脏毒性、生殖毒性、细胞畸变，对动物肠胃和骨骼也有一定的损害作用，因此对人类和动物的健康有严重的危害[13]。

2.2.3 烟曲霉

烟曲霉(Aspergillusfumigatus)是自然环境中广泛存在的条件致病真菌，气传孢子，它的感染途径是被宿主吸入呼吸道末端，过程中提高自身的侵入能力以及抵御机体免疫系统的杀伤力而产生一些蛋白酶。环境中普遍存在的腐生丝状真菌烟曲霉在免疫功能低下或缺陷的人群中可引起多种急慢性疾病, 包括致死率很高的侵袭性曲霉病、过敏性哮喘、肺炎及变应性支气管肺曲霉病[14]。

2.2.4 聚多曲霉

聚多曲霉(Aspergillussydowii)亦称为喜多氏曲霉，是一种条件致病菌，属于丝孢菌目、丛梗孢科、曲霉属的一个种, 可生长在土壤、粪便、酒曲等多种材料的基物上。

2.2.5 小孢根霉

小孢根霉(Rhizopusmicrospores)为条件致病菌，具有呈梨状的孢子囊，灰色的气生菌丝，分生孢子呈圆形，虽然不直接污染物料，不直接造成产品的安全性危害，但可引起食品霉变，从而导致成品污染。

本研究通过对日本移民研究领域已发表的核心期刊论文进行统计分析，基于文献计量学原理，利用社会网络分析法对关键词共现矩阵做了网络化分析，根据关键词共现网络的拓扑结构和节点的测地距离，基本上探测出目前该领域的研究热点集中在三个方面：日本在东北地区的移民侵略研究；日本移民在其他国家地区的政策研究以及日本移民侨居广州的社会学研究，其中重点研究是日本在东北地区的移民侵略研究。

2.2.6 黑曲霉

黑曲霉(Aspergillusniger)属于曲霉属真菌中的一种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品、空气和土壤中，能导致水分较高的粮食和果蔬的腐败变质和其他工业器材霉变，有的种可产生致癌性的霉毒素[15]。

2.2.7 构巢裸胞壳菌

构巢裸胞壳菌(Emericellanidulanss)分生孢子结构大量或较少，呈不同程度的绿色。有部分闭囊壳散在其间，被壳细胞所包围，使表面显现黄色团块或絮状颗粒结构[16]。分布在土壤、空气、粮食、饲料、霉腐物、脑曲霉病患者等。对人体和动物都有致病性，能产生有毒代谢产物。

2.2.8 谢瓦散囊菌

谢瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)菌落生长缓慢，具有辐射状沟纹，黄褐色。广泛分布于世界各地，存在于土壤、药材(冬青子、栀子、陈皮)、粮食、霉腐物，主要引起物质的腐败变质，存在于烟仓腐败物中。

2.2.9 邬氏黄丝曲霉

邬氏黄丝曲霉(Talaromyceswortmannii)菌丝适宜生长的温湿度是25～30 ℃、高于97%，光照对其菌丝的生长影响较小，菌落呈黄色，其孢子呈白色或者淡黄色。分生孢子成椭球形，孢梗茎壁光滑，顶端不膨大，帚状双轮生。对人体和动物都有致病性，能产生有毒代谢产物。

纠结青霉(Penicilliumimplicatum)为条件致病菌，有脐状突起、质地绒状或有絮状；大量产生孢子，呈蓝绿色；菌丝体呈白色；可溶性色素类似反面的颜色。青霉菌又可以分泌青霉素，青霉菌导致青霉病，主要包括：马尼菲青霉病(在人体抵抗力低下时，通过呼吸道进入体内引起肺部感染，然后经过血循环扩散至皮肤、肝脾等器官)、肺青霉病(菌种在一定条件下可引起青霉菌病和肺青霉病)、梨状青霉病(危害贮藏期的果实)。

2.2.11 梅花状青霉

梅花状青霉(Penicilliumherquei)各顶端的小梗产生链状的分生孢子并从菌丝体伸向空中，最佳生长、萌发温湿度是25～30 ℃，高于97%，光照和黑暗交替条件能促进菌丝的生长，从土壤或空气中很易分离，对人体和动物都有致病性，能产生有毒代谢产物。

2.2.12 鲍曼不动杆菌

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)属于不动杆菌属的一个菌种，无芽孢无鞭毛，不能运动，非发酵革兰氏阴性杆菌，属于条件致病菌，是医院感染的重要病原菌且耐药性日益严重，主要引起呼吸道感染，也可引发败血症、泌尿系统感染、继发性脑膜炎呼吸机相关肺炎等。在医院的环境中分布很广且可长期存活，对危重患者、CCU、 ICU中的病患能造成严重的影响，被称之为 ICU获得性感染。

2.2.13 金黄色葡萄球菌亚种

金黄色葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)具有革兰氏阳性、阴性凝固酶、不运动、不产孢子的特点，可以产生多种毒素，这也是金黄色葡萄球菌导致食物中毒的原因。导致组织坏死的原因是金黄色葡萄球菌定居于毛囊后，具有强致病性，可引起轻微的皮肤软组织感染、局部炎症，产生威胁生命的中毒性休克样综合征毒素-1、败血症、骨髓炎、心内膜炎、肺炎和脑膜炎等多种疾病。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，在空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的机会很多。

2.2.14 蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)是芽孢杆菌属中的一种，菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，存在于土壤、水、空气以及动物肠道中。可引起食物中毒，中毒者症状为腹痛、恶心、呕吐和腹泻。在高含糖量的食物中生长,如粮食加工品和肉制品等引起食物中毒的毒力因子主要为NHE、HBL、细胞毒素K、肠毒素FM及Cereulide。大分子蛋白的溶血毒素和非溶血性毒素,是引起腹泻型食物中毒的主要原因。

2.2.15 克氏库克菌

克氏库克菌(Kocuriakristinae)属于库克菌属，是一种条件致病菌，革兰氏阳性球菌，兼性厌氧。该菌主要分布在自然环境中以及哺乳动物、人的皮肤、黏膜和口咽部。近年来由该菌引发的感染病增加较快，在血流感染和皮肤软组织感染等。

2.2.16 抗辐射不动杆菌

抗辐射不动杆菌(Acinetobacterradioresistens)属条件致病菌，革兰氏阴性球杆菌，可单个存在， 革兰氏染色不易褪色，粘液性型菌株有荚膜，无芽孢，无鞭毛。分布于外界环境中，易在潮湿环境中生存，由于该菌粘附力极强，这也是其成为贮菌源的原因。病发症包括肺部、伤口、皮肤、泌尿生殖系统感染、菌血症及脑膜炎等。

2.2.17 普罗威登斯菌属

普罗威登斯菌(Providenciaspp.)主要特性为杆状，革兰氏阴性，周生鞭毛，具有运动性，兼性厌氧。可从腹泻大便、尿道感染、伤口、烧伤和菌血症标本中分离，是引起人类尿道感染、腹泻、败血症的病原菌。

2.2.18 藤黄微球菌

藤黄微球菌(Micrococcusluteus)是一般不致病，但可为条件致病菌。为革兰氏染色阳性，接触酶阳性，不分解葡萄糖，好氧或兼性厌氧的球状细菌。分布于空气、土壤、水以及动植物体表，引起伤口等局部组织感染，也能引起严重感染，如心内膜炎、脑膜炎、感染引起败血症等疾病。具有产色素的能力，一旦在成品糖中大量繁殖，会对成品糖的色泽产生影响，损坏品质。

2.2.19 红串红球菌

红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)具有产色素的能力，一旦在成品糖中大量繁殖，会对成品糖的色泽产生影响，损坏品质。

2.2.20 出芽短梗霉

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)是一类多形态类酵母真菌, 具有酵母样和真菌菌丝体2种形态。出芽短梗霉可产生多种代谢产物, 如胞外多聚糖、酶、抗菌素及单细胞蛋白等, 是一种很有开发价值和应用前景的多功能新型生物制品。

2.2.21 解脂耶氏酵母菌

解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)属子囊酵母，是一种二型性真菌。与白色念珠菌一样，随着外界信号刺激的改变，解脂耶氏酵母菌的细胞形态也会在酵母、假菌丝以及菌丝形态之间相互转化。解脂耶氏菌可以以葡萄糖、乙醇、乙酸、脂肪酸、烃类等物质为碳源进行生长，具有适应较恶劣的环境条件。

2.2.22 粘性红酵母

粘性红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)为单细胞真菌，菌落呈球形、圆形,中间凸起,表面及边缘光滑，一般为粉红色,以芽殖为主。菌落生长快速，反面阴暗，有时粗糙，柔软，呈粘液状。粘性红酵母具有产色素的能力，若大量繁殖，会对成品的颜色产生影响，损坏其品质。

2.3 检出微生物的分布特点

2.3.1 生产线样本及糖垢样本中检出的微生物

生产线样本是指分蜜机落糖口以下、振筛、输送带上的糖，糖垢样本是分蜜机落糖口、振筛、输送带上的糖积垢。生产线样本及糖垢样本中检出的微生物见表6。

表6 生产线样本及糖垢样本中检出的微生物

续 表

2.3.2 致病性及致害性微生物的检出位点

致病性及致害性微生物的检出位点见表7和表8。

表7 致病性微生物检出位点

表8 致害性微生物检出位点

3 分析与讨论

从不同糖厂的成糖工段洁净区(含部分糖厂煮糖车间)检出大量微生物，包括致病性微生物、致害性微生物，其中一些检出菌为初次报道。

检测的所有糖厂振筛末端生产线样品均未检出致病性微生物及致害性微生物。但是，洁净区分布的致病性微生物及致害性微生物对成品糖安全及品质的可能影响亟待研究。

生产线样本用现行方法检出的微生物数量、种类变化呈现规律：随振筛级数递减，落糖口处最高，末级振筛末端最少。该变化与生产线样本的水分含量变化相关。但是，生产线样本中是否携带芽孢和霉菌孢子需要进一步实验研究。

检出微生物以芽孢杆菌、曲霉、青霉最为普遍。

不同企业洁净区空气、建筑表面、设备表面的微生物分布有较大的差异。气流组织状况、积水、糖浆积留、糖粉积留是影响微生物分布的重要因素。

生产线糖垢样本微生物检出数量大，与生产线样本相对照，两组样本检出菌株存在极高的同缘性。生产上要注意糖垢的及时清理。

本文介绍了几家糖厂成糖洁净区检出的微生物种类。关于甘蔗糖厂成糖洁净区微生物分布状况分析、成品糖微生物污染源、污染途径分析、成糖洁净区微生物风险评估的研究工作将另文报道。