小茴香精油成分测定及性能研究

2019-11-15 00:45姜楠楠陈小亮董娜王建清
中国调味品 2019年11期
关键词:离子流小茴香茴香

姜楠楠,陈小亮,董娜,王建清

(1.河南工学院,河南 新乡 453000;2.天津科技大学,天津 300222)

小茴香(FoenicuzuvulgareMill.)为伞形科植物茴香的干燥成熟果实,不仅是一种调味品,而且是传统中药。钟瑞敏等针对小茴香籽精油对7种食源性致病菌和2种腐败性真菌进行抗菌活性研究,小茴香籽精油表现出优良的广谱性抗菌活性,其中黑曲霉和副溶血性嗜盐菌对该精油的最小抑菌量(MIC)分别小于0.004%和0.015%(体积分数)[1]。陈佳丽等从烧鸡中分离、鉴定出腐败菌为产黄青霉菌,将小茴香等香辛料对其腐败菌进行抑菌效果研究,最小抑菌浓度为0.8 g/mL[2]。

本文采用水蒸气蒸馏法从小茴香果实中提取精油。采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析小茴香精油的化合物成分,对其进行定性与定量。通过傅里叶红外光谱对小茴香精油主要成分在光照时长与pH值条件下的稳定性进行分析。并对小茴香及其主要成分对青霉的抑菌效果进行测试,显示效果良好。通过对小茴香及其主要成分测定及性能分析,为小茴香的进一步开发利用研究提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验所用材料

小茴香(食品级):甘肃省安国市祁澳中药饮片有限公司;95%乙醇(分析纯)、蒸馏水、草酸(分析纯):天津基准化学试剂有限公司;氯化钠(分析纯)、蔗糖(分析纯):天津市江天化工技术有限公司;琼脂(生物试剂):天津市珠江卫生材料厂;反式茴香脑标准品(色谱纯):Sigma-Aldrich公司;4-烯丙基苯甲醚标准品(色谱纯):ACROS公司;青霉(生化试剂):天津科技大学食品与生物技术学院。

1.2 实验所用仪器与设备

HY34型电子天平 奥豪斯仪器有限公司;AR2130型千分之一电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;FW177型中草药粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司;DGG型电热鼓风干燥箱 天津天宇机电有限公司;Varian 4000MS型GC-MS色谱仪 美国瓦里安公司;Eppendorf型移液枪 北京东南仪诚试验室设备有限公司;DHP-9052型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;Check Mate 9900型气体分析仪 丹麦拔萃公司;VECTOR 22型傅立叶变换红外光谱仪 德国布鲁克仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小茴香精油提取

图1 常压水中蒸馏装置

1.3.2 小茴香精油成分分析

1.3.2.1 小茴香精油GC-MS分析

色谱条件:柱子型号:VF-5MS,30 m×0.25 mm×0.25 μm;进样口温度:300 ℃;分流比:100;载气:He,99.999%;流速:1 mL/min;程序升温:初始温度100 ℃,然后以10 ℃/min升至300 ℃,保持10 min。质谱条件:离子源:EI;离子阱温度:220 ℃;传输线温度:280 ℃;扫描方式:全扫描;扫描范围:50~500 m/z。利用NIST05 标准质谱库-计算机联机检索。

1.3.2.2 小茴香精油主要成分定性/定量分析

定性分析:取1 mL样品稀释1000倍取1 μL进样,利用NBS75K标准质谱库-计算机联机检索,与质谱图集的标准谱图进行对照,结合有关文献进行人工谱图解析,确认样品中的各个化学成分及其相对含量。

定量分析:取样品、主要成分的标准品分别稀释1000倍,再分别稀释到100,50,20,10,5 mg/L,然后各取1 μL进样,在同等的条件下进行GC-MS分析。运用气相色谱外标法建立样品的标准曲线,计算出主要成分的绝对含量。

1.3.3 小茴香精油主要成分稳定性分析

采用傅里叶变换红外光谱仪对反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚标准品的稳定性进行分析。具体方法:采用压片法,取干燥的KBr粉末0.15 mg,在玛瑙研钵中研细混合均匀后,加入压模内,制成一定直径及厚度的透明片。在此薄片上滴少许标品经自然光照射0,1,2,3,4,5 h后,将此薄片放入仪器光束中进行测定,扫描范围为500~4000 cm-1。以官能团变化评价光照对稳定性的影响。将4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑通过NaOH醇溶液和HCl醇溶液稀释至pH 2和pH 10的酸碱溶液,静置1 h用KRS5液体红外检测池测定其红外吸收波峰,以官能团的变化评价pH值对稳定性的影响。

1.3.4 小茴香精油抑菌效果实验

1.3.4.1 试样准备

供试菌株的制备:选取的供试菌株为青霉,分离自发病樱桃果实。将供试菌种转接到相应的斜面培养基上,置于28 ℃培养48 h。取2支供实验用,其余冷藏备用。

培养基的制备:具体配方:马铃薯200 g,蔗糖(或葡萄糖)20 g,琼脂14~20 g,水1000 mL,pH自然。制作要点:马铃薯去皮,切成块煮沸30 min,然后用纱布过滤,再加糖及琼脂,溶化后补足水至 1000 mL。分装,高压湿热灭菌(121 ℃,20 min)备用。

菌悬液的制备:挑取菌落接种平皿,霉菌培养48 h,用无菌生理盐水洗脱,玻璃珠打散,制成菌悬液,调菌悬液浓度为107CFU/mL备用。

1.3.4.2 抑菌活性研究(滤纸片扩散法)

将直径为6 mm的圆形空白滤纸片经160 ℃干热灭菌2 h后,无菌条件保存备用。用无菌移液器吸取活化并调整好菌液浓度的各菌悬液0.3 mL加入到已倒好培养基的培养皿中,干热灭菌玻璃涂布器将菌悬液涂布均匀。将无菌滤纸片放入培养皿中央,用无菌移液枪吸取10 μL植物提取物到滤纸片上,每种菌平行做2个皿,然后用相应的提取溶剂作阴性对照。细菌在生化培养箱中37 ℃恒温培养24 h,霉菌在生化培养箱中28 ℃恒温培养48 h,采用十字交叉法量取抑菌圈直径,取平均值。

2 结果与讨论

2.1 小茴香精油成分分析

2.1.1 小茴香精油GC-MS 分析

按1.3.2中气相色谱-质谱(GC-MS)条件对水蒸气蒸馏提取制得的小茴香精油进行成分分析,其GC色谱图总离子流图见图2。利用NIST05 标准质谱库-计算机联机检索系统,与质谱图集的标准谱图进行对照、复合,结合有关文献确定小茴香精油主要化学成分,再结合毛细管气相色谱面积归一化法对各组分的相对含量进行计算,分析鉴定结果见表1。

图2 小茴香水蒸气蒸馏提取物的总离子流图

峰号化合物名称保留时间(min)百分含量(%)1异丙基甲苯3.4380.1762双戊烯3.4961.2993桉叶油3.5620.12644-异丙基-1-甲基-1,4-环己二烯3.8100.7225松油烯4.1830.02661,3,3-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-酮4.3171.17472,6-二甲基-2,4,6-辛三烯4.7100.0278左旋樟脑5.2970.04394-萜品醇5.8110.064104-烯丙基苯甲醚6.093.996112,4,6-三甲基苯甲醛7.2370.20912对甲氧基苯甲醛7.3970.04313反式茴香脑8.02592.03

2.1.2 小茴香精油主要成分的定性、定量分析

2.1.2.1 小茴香精油主要成分定性分析

GC-MS相同条件进样,保留时间一致可判定为同种物质。4-烯丙基苯甲醚、反式茴香脑标准品和小茴香精油的总离子流图谱的对比。由图3可知,4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑是小茴香提取物的主要化学成分,总离子流图谱出峰时间与化合物的种类相对应,所以判定小茴香提取物总离子流图谱中第一个主要峰代表4-烯丙基苯甲醚,第二个主要峰代表反式茴香脑,此结果进一步验证了NIST05 标准质谱库分析结果,与钟瑞敏、郭婷婷等[3]关于小茴香主要成分的报道相一致。总离子流图谱上的峰面积代表该化学成分的相对含量,由图3可知,小茴香提取物中反式茴香脑的含量高于4-烯丙基苯甲醚。

图3 反式茴香脑、4-烯丙基苯甲醚标品与小茴香提取物的总离子流对比图

2.1.2.2 小茴香精油主要成分定量分析

反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚标品根据GC-MS条件依次稀释至5,10,20,50,100 mg/L等一系列浓度后,气相色谱质谱分析得5个浓度总离子流图谱[4],见图4和图5。

图4 不同浓度下4-烯丙基苯甲醚标准品的总离子流图谱

图5 不同浓度下反式茴香标准品的总离子流图谱

分别记录4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑在不同浓度相对出峰面积,以浓度为横坐标,相对峰面积为纵坐标分别做4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑的标准曲线,见图6和图7。

根据图4的图谱分析结果,以浓度为横坐标,相对峰面积对纵坐标,运用气相色谱外标法建立样品的标准曲线,见图6。由标准曲线得4-烯丙基苯甲醚线性回归方程为y=1863x+4544.7。将稀释10000倍的小茴香精油在同样条件下进样,利用毛细管气相色谱面积归一化法计算小茴香挥发油中4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑相对含量,代入标准曲线方程多次进样取平均值,结果表明小茴香精油中4-烯丙基苯甲醚绝对含量为32.23 mg/mL。

图6 4-烯丙基苯甲醚浓度标准品曲线

根据图5的图谱分析结果,以浓度为横坐标,相对峰面积对纵坐标,运用气相色谱外标法建立样品标准曲线,见图7。由标准曲线得反式茴香脑的回归方程y=2301x-9205。将稀释10000倍的小茴香精油在同样条件下进样,利用毛细管气相色谱面积归一化法计算反式茴香脑相对含量,代入标准曲线方程多次进样取平均值,结果表明小茴香精油中反式茴香脑绝对含量为96.7 mg/mL。

图7 反式茴香脑线性回归图

2.2 小茴香精油主要成分稳定性研究

2.2.1 反式茴香脑稳定性分析

图8 傅里叶红外光谱法反式茴香脑对不同 pH值的稳定性分析

由图8可知,处理后的红外谱图相对于空白样,无能量的偏移和价键的生成,说明反式茴香脑比较稳定,pH值没有引起其结构发生改变。

图9 傅里叶红外光谱法反式茴香脑对光照的稳定性分析

经不同光照时间照射组与未经过光照照射组对比,红外光谱图变化不大,只有在3417 nm处光照1 h样品吸收峰较大,这可能是由于此样品量相对于其他组较多,从而使此处价键的吸收峰值变大,属于误差影响导致[6]。综上所述,反式茴香脑对光照时长变化、pH值变化条件均比较稳定,这些因素的改变没有引起其结构性质发生改变。

2.2.2 4-烯丙基苯甲醚稳定性分析

选取不同pH值和光照时间为研究对象,通过傅里叶红外光谱对4-烯丙基苯甲醚进行分析,见图10和图11。

图10 傅里叶红外光谱法4-烯丙基苯甲醚对pH值稳定性分析

图11 傅里叶红外光谱法4-烯丙基苯甲醚对光照的稳定性分析

用NaOH醇溶液和HCl醇溶液将4-烯丙基苯甲醚和小茴香精油稀释到相同浓度10-3后,测定其在pH 2和pH 10条件下的红外光谱图[7]。由图10可知,酸碱处理后分子价键无偏移和伸缩震动,说明没有新的价键生成和减少。只是在3423 nm处,相对于空白样,酸碱处理后峰的强度增大,这可能是氢键结合醇和羧酸能力增强所导致的[8]。由图11可知,不同光照时间处理后,处理组相对于对照组几乎没有变化,说明4-烯丙基苯甲醚对光不敏感,光照对稳定性影响不大。

2.3 小茴香精油主要抑菌成分筛选

小茴香、反式茴香脑、4-烯丙基苯甲醚对青霉抑菌6 d后效果图见图12[9]。

图12 小茴香精油及其主要成分对青霉抑菌效果图

由图12可知,6 d后小茴香对青霉抑菌圈直径为9 cm 。对比反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚的抑菌效果发现,同样时间下4-烯丙基苯甲醚抑菌圈直径较小,为4 cm,而反式茴香脑培养皿刚刚有菌丝生长,说明反式茴香脑的抑菌效果较好,并优于4-烯丙基苯甲醚[10],证明小茴香中起到抑菌作用的主要成分为反式茴香脑。

3 结论

采用水蒸气蒸馏法从小茴香中提取精油。通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对小茴香水蒸气蒸馏提取精油进行定性分析,结果表明:小茴香精油主要成分为反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚。用毛细管气相色谱面积归一化法计算小茴香挥发油中4-烯丙基苯甲醚和反式茴香脑相对含量,代入标准曲线方程多次进样取平均值得反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚绝对含量分别为96.7 mg/mL和32.23 mg/mL。

采用傅里叶红外光谱(FRIT)技术对小茴香精油两种主要成分在光照、pH 2与pH 10的条件下测试稳定性,结果表明:酸碱条件与光照时间变化条件没有引起反式茴香脑和4-烯丙基苯甲醚新官能团生成和能量的偏移,说明酸碱条件与光照条件对其稳定性的影响极小。

研究小茴香及其两种主要成分对青霉的抑菌效果,结果表明反式茴香脑抑菌效果最好,优于4-烯丙基苯甲醚。

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