固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定海产品中谷氨酸钠的含量

张晓瑜，张桂芳，王志昱，张艺，董桂贤

(烟台市疾病预防控制中心，山东 烟台 264003)

鲜味是人们饮食中不可缺少的美味之一。我国将多种化合物的综合味感均定义为鲜味[1]，其中L-谷氨酸钠(以下称为谷氨酸钠)作为最主要的鲜味调味品，价格低廉，不仅在日常的餐饮中被大量使用，而且在食品加工行业中也被广泛应用[2]。虽然多国研究提出，正常摄入量的谷氨酸钠对人体相对安全[3-6]，但在2017年，欧盟一项研究发现谷氨酸对大鼠造成不良效应的摄入量为每公斤体重3.2 g，在此基础上制定了谷氨酸及其盐类的ADI为每天30 mg/kg·BW[7],目前我国尚缺少谷氨酸钠日常摄入量的统计数据。素有“海鲜”之称的海产品，虽然含有丰富多样的自然鲜味物质[8]，但其鲜味会因储存不当而流失或被产生的异味掩盖。所以，海产品在加工过程中会添加大量的谷氨酸钠以增加风味、掩盖异味。精加工海产品作为谷氨酸钠添加量较大的一类食品，其安全性已引起社会关注。

食品中谷氨酸钠的主要检验方法有高氯酸非水溶液滴定法、旋光法、酸度计法[9]，上述方法只适用于味精产品中谷氨酸钠含量的检测，但不适用于基质复杂的食品样品。且目前尚无食品样本中谷氨酸钠含量测定的国家标准或规范性检测方法[10]。本方法针对海产品样品基质复杂的特点，建立一种操作简单、高效灵敏、准确可靠的检测方法，采用固相萃取-液相色谱-串联质谱技术，应用于对本地区40份海产品中谷氨酸钠含量的检测，结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

Agilent 1260-G6460高效液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪(配有电喷雾离子源 ESI) 美国Agilent公司；OA-sys氮吹仪 美国Organomation公司；SUP-100固相萃取仪 美国Supelco公司；均质器、高速冷冻离心机、涡旋混匀器、电子天平等。

1.1.2 主要试剂及耗材

乙腈、甲醇、甲酸(均为色谱纯，德国默克公司)、氨水(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、氯化钠(分析纯)、MAX混合型离子交换固相萃取柱(CNW公司)、L-谷氨酸钠盐(纯度>99.9%，美国Cato公司)等。试验用水均为一级。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

美国安捷伦PFP色谱柱(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)，采用梯度洗脱方式，流动相分别为A：0.2%(体积分数，下同)甲酸/水，B：0.2%甲酸/乙腈，梯度洗脱程序见表1。流量为0.20 mL/min，进样量为1 μL，柱温为40 ℃，谷氨酸钠保留时间为1.116 min。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正离子模式扫描，离子源温度300 ℃，离子喷雾电压4500 V，雾化气流速氮气5.0 mL/min，喷雾器压力45 PSI，脱溶剂气流速：氮气11.0 mL/min，多反应监测(MRM)模式，谷氨酸(盐)定性定量离子对：m/z 148.0～84.1， m/z 148.0～56.1，碰撞能分别为13，25 eV。

1.3 实验方法

样品分别置于均质器中粉碎10 min。称取1.0 g粉碎样品于50 mL离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L 盐酸水溶液，涡旋2 min，冷冻离心5 min，取1 mL上清液，经玻璃纤维滤纸过滤后，并用0.1 mol/L 盐酸水溶液冲洗滤纸，合并冲洗液定容至100 mL。按照样品中谷氨酸钠的含量用0.1 mol/L 盐酸水溶液进行稀释(依据2.2中的稀释方法)，然后取1 mL溶液待净化。以1 mL 5% 氨水活化MAX柱并抽干，1 mL待净化溶液加入1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中和后，将2 mL中和液上样，以0.5 mL纯水淋洗2次，0.5 mL甲醇淋洗2次后，弃去淋洗液。用1 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脱2次，合并洗脱液，氮气吹干后，用1 mL初始流动相复溶，经0.22 μm滤膜过滤后用于测定。

2 结果与讨论

2.1 预处理条件选择

海产品种类较多，基质含量复杂，含有大量盐类、糖类、蛋白质、脂肪等，对样品前处理要求较高。本研究分别以40份匀浆后的新鲜海产品和人工添加谷氨酸钠的精加工海产品为研究对象，分别考察了盐酸水溶液、盐酸甲醇溶液、盐酸乙腈溶液的提取效果。通过实验发现，盐酸水溶液回收率较高，满足样本测定要求；溶解脂肪等杂质较少，容易过滤。综合考虑，本实验选择0.1 mol/L盐酸水溶液作为提取溶剂较为适宜。

2.2 MAX柱对谷氨酸钠的载量与优化

提取后的溶液中除谷氨酸钠外还溶解了大量的杂质，故选择吸附-解吸原理的MAX固相萃取柱。但海产品特别是精加工海产品中谷氨酸钠含量过高，在实验过程中，MAX固相萃取柱容易过载，因此分别采用不同的加标浓度对MAX柱萃取回收率进行验证，回收率试验见表2。故应将上柱前谷氨酸钠配制在500 ng以下较为理想。根据多次实验结果，未添加谷氨酸钠的散装新鲜海产品的稀释倍数为1000～2000倍较为理想，人工添加谷氨酸钠的精加工海产品的稀释倍数可采用5000～10000倍。仪器测定超过500 μg/L结果时需要加大稀释倍数后重新进行固相萃取。

表2 不同浓度下的MAX柱的回收率测定结果

2.3 质谱条件的优化

根据待测物的性质，配制1000 μg/L的标准溶液，在ESI+模式下分别进行质谱条件优化，第一步进行母离子扫描，确定母离子，并优化得到碰撞能。同时在MRM模式下优化了离子源温度、喷雾器压力、脱溶剂气流速。确定优化后条件见1.2.2。MRM特征离子谱图见图1。

图1 MRM特征离子谱图

2.4 校准曲线和检出限

将谷氨酸钠标准品用初始流动相配制成10，20，50，100，200，500 μg/L浓度的系列标准溶液，以峰面积对浓度绘制标准曲线。以3倍信噪比(S/N)，10倍信噪比(S/N)确定检出限和定量限。回归方程为Y=375.63X+720.42，相关系数r为0.9998。仪器检出限为1.5 μg/L，定量限为5.0 μg/L。

2.5 精密度、稳定性、加标回收率和基质效应

2.5.1 精密度试验

将某样品按1.3的方法重复提取测定6次，测定值见表3，计算得相对标准偏差(RSD)为2.4%，精密度符合试验要求。

表3 某样品重复6次测定值

2.5.2 稳定性试验

同时取供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12 h进样，在仪器工作条件下进行测定，结果见表4。计算得相对标准偏差(RSD)为1.9%，稳定性良好，符合试验要求。

表4 谷氨酸钠稳定性试验

2.5.3 加标回收率

将加标样品按1.3的方法提取，按前述确定的测定条件进行测定，确定回收率，结果见表5，平均回收率为97.9%。

表5 谷氨酸钠回收率试验

2.5.4 基质效应

取加标供试品(加标浓度水平在10.0,50.0,100.0 μg/L)按照1.3的方法提取，按前述确定的测定条件进行测定，确定基质效应。测得基质效应为95.8%～101.2%。样品和标准品的谱图见图2。

图2 标准品及样品的色谱图

2.6 样品分析

随机抽取市售海产品40份，其中包含未加工海产品20份(其中包括鱼类、虾类、贝壳类、软体动物类)、精加工海产品20份(其中包括散装和成品包装的鱼类、虾类、软体动物类)，应用本方法进行测定，40份样品均有谷氨酸钠检出(56.1×104～6.35×104mg/kg)，检出率为100%，其中未加工海产品谷氨酸钠含量(56.1×103～1.28×103mg/kg)的平均值为5.01×102mg/kg，精加工海产品谷氨酸钠含量(59.5×104～6.35×104mg/kg)的平均值为1.36×104mg/kg。有部分精加工海产品配料表中没有加入谷氨酸钠(其中包括部分散装产品没有标示是否加入谷氨酸钠)，精加工海产品谷氨酸钠检出最低值与未加工海产品最低值相近，说明部分精加工海产品未加入谷氨酸钠。而精加工海产品谷氨酸钠含量平均值显著高于未加工海产品，与实际情况相符。

3 结论

基于海产品类样品基质复杂的特点，本研究建立了一种快速高效、灵敏、准确的固相萃取-液相色谱-串联质谱检测技术。并对固相萃取样品前处理方法中的溶剂提取、柱载量等反复试验，优化条件，可满足市售海产品中谷氨酸钠含量的测定要求。该方法填补了目前一般食品中尚无谷氨酸钠国家标准检测方法的空白，同时对其他食品中谷氨酸钠检测方法的研制具有借鉴意义。