离子色谱法同时测定酱油中亚硝酸盐与硝酸盐

陈俊秀，张秀清，张瑞雨，梁孟军，马晓年

(云南省昆明市疾病预防控制中心，昆明 650228)

酱油是中国的传统调味品，因其具有独特酱香，滋味鲜美，常用于食物调味，同时也是人们日常生活中获取盐类的一个重要来源。亚硝酸盐外部感官和滋味都与食盐有相似之处[1]，且亚硝酸盐可作为食品中的防腐剂，可延长食品的保质期，但亚硝酸盐引起中毒的机率很高，在体内积累会对人体造成严重危害[2]，亚硝酸盐与食品中有机胺类化合物形成亚硝胺，大量或长时间摄入能够诱发肿瘤，进而引起癌症的发生。而在还原菌的作用下、高温蒸煮或长期置于有氧环境下，硝酸盐则会转化成亚硝酸盐，所以硝酸盐往往表现为亚硝酸盐的毒性。现行的酱油国家标准未涉及亚硝酸盐和硝酸盐的检测要求，但在出口酱油中却要求检测[3]。目前，亚硝酸盐和硝酸盐的检测方法有电学化学法[4]、荧光法[5-7]、分光光度法[8，9]、离子色谱法[10，11]。

本研究应用抑制电导-离子色谱法检测酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的含量，样品前处理使用试剂少，操作简便，环保，可用于酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

ICS-2100型离子色谱仪 美国ThermoFisher 公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XS205DU型分析天平(十万分之一) 瑞士Mettler Toledo 公司；C18柱、Ag柱、Na柱(1.0 mL) Agela Technologies公司；注射器(1.0 mL)；0.22 μm水性滤膜 天津津滕公司。

亚硝酸盐标准溶液(100 mg/L)：环境保护部标准样品研究所；硝酸盐标准溶液(1000 mg/L)：中国计量科学研究院；去离子水：由美国Sartorius公司纯水处理终端机制得。

样品为市售酱油制品。

1.2 标准溶液的配制

标准工作液：精密量取亚硝酸盐标准溶液和硝酸盐标准溶液各1.0 mL于100 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，得1.0 mg/L亚硝酸盐和10.0 mg/L硝酸盐混合标准工作液。

标准工作曲线：准确吸取标准工作液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0，20.0 mL于100 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度。

1.3 样品前处理

准确称取样品5 g(精确到0.01 g)，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL，摇匀，在25 ℃条件下超声30 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度，混匀。将样品溶液依次通过0.22 μm水性滤膜、C18柱、Ag柱和 Na柱，弃去前面7 mL，收集后面洗脱液，置于样品管中待测。C18柱、Ag柱和 Na柱使用前需要活化，柱子活化程序如下：C18柱依次用10 mL甲醇、15 mL水通过，静置活化30 min；Ag柱和 Na柱用10 mL水通过，静置活化30 min。

1.4 仪器条件

色谱柱：Dionex IonPac AS11-HC(4 mm×250 mm)，带IonPac AG11-HC 型保护柱(4 mm×50 mm)；AERS-500(4 mm)型抑制器；Dionex电导检测器；检测池温度35 ℃；进样体积为25 μL；流速为1.0 mL/min；淋洗液为KOH溶液，淋洗液梯度洗脱程序见表1。

表1 淋洗液梯度洗脱

2 结果与分析

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 样品提取条件的优化

称取样品后，采用超声水浴方法进行提取，分别选择不同的温度和提取时间并计算不同时间与温度时的提取效率，经查阅文献[12]，水温25 ℃超声30 min提取效率高并且节约时间，因此采用该条件作为样品提取条件。

2.1.2 样品净化条件的选择

样品超声提取后，将滤液依次通过0.22 μm水性滤膜、C18柱；0.22 μm水性滤膜、C18柱、Ag柱；0.22 μm水性滤膜、C18柱、Na柱；0.22 μm水性滤膜、C18柱、Ag柱和 Na柱4种净化方法。因酱油样品中含有氯化物，会对亚硝酸盐峰形有遮盖，实验表明C18柱可去除样品中有机物，而Ag柱和 Na柱可去除样品中氯化物，达到峰形稳定、无杂质干扰，而Ag柱除氯效果明显优于Na柱，因此经过比较，本实验可选择样品通过0.22 μm水性滤膜、C18柱、Ag柱，条件允许下样品可通过0.22 μm水性滤膜、C18柱、Ag柱和 Na柱，效果更佳。4种净化方法色谱图见图1。

图1 4种净化方法色谱图比较

2.2 色谱条件的选择

本次试验的离子色谱体系为KOH体系，为了减少其他物质干扰，同时保证2个目标物出峰，并且缩短分析时间，选择淋洗液初始浓度为5.0～50.0 mmol梯度洗脱，因流速过快会导致峰面积减小，过慢则会使峰形拖尾，因此选择流速为1.0 mL/min。在此条件下，2种离子分离良好，峰形对称。标准样品色谱图见图2。

图2 标准样品色谱图

2.3 方法研究及结果分析

2.3.1 线性关系考察

配制亚硝酸根离子浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20 mg/L，硝酸根离子浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0 mg/L的系列混合标准溶液。以目标物浓度(X)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，计算得到回归方程及相关系数，具体数据见表2。

表2 2种目标物的线性回归方程、相关系数、线性范围及检出限

2.3.2 方法精密度

准确称取5.00 g 空白样6份，加入5.0 mL亚硝酸盐和硝酸盐混合标准工作液，按照样品预处理方法制备样品溶液，重复测定，计算精密度。相对标准偏差结果见表3。实验结果表明，该方法的精密度良好。

表3 重复测定的精密度(n=6)

2.3.3 加标回收率

准确称取空白样品9份，分为3组，分别加入混合标准工作液。按照样品预处理方法制备样品工作液后测定，计算平均加标回收率，结果见表4。

表4 目标化合物在不同加标水平下的加标回收率(n=3)

3 结论

本研究建立同时检测酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱分析方法，直接超声提取，避免了提取过程中目标物的损失；样品前处理方法简单，使用化学试剂量少，环保安全；以KOH作为流动相，响应高，峰形窄。实验结果表明，本方法具有良好的回收率和精密度，适用于酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的检测。