PD1蛋白表达在浸润性乳腺癌中的临床意义

杨丽萍 罗庆丰 高 玟 孙正魁 李江龙 梁璟慧 王烈亮

乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤，本研究应用免疫组化法检测改良根治术后乳腺癌患者的PD1蛋白表达情况，探讨PD1/PDL1信号表达情况与乳腺癌临床病理特征和相关分子表型的关系，为乳腺癌患者的合理治疗选择做出有益的探索。

1 材料与方法

1.1 一般资料

江西省肿瘤医院2013年5月至2016年5月收治117例乳腺癌患者，经病理检查确诊为浸润性导管癌，均为女性，年龄32～68岁，平均年龄(50.8±2.6)岁。

1.2 主要试剂

PD1购自北京中杉金桥生物技术有限公司，克隆号MRQ-22,为工作液，参考滴度为1∶200。

1.3 标本采集与处理

117例乳腺癌标本经过病理检查证实为浸润性导管癌，检测肿瘤PD1表达采用MaxvisionTM免疫组化法，按照PD1试剂盒的操作说明进行，具体步骤：①4 μm连续切片，裱于涂有APES的载玻片上，70 ℃烤片2 h;②二甲苯脱蜡2次，5个梯度酒精脱水；③3%H2O2室温孵育30 min；④pH 6.0柠檬酸溶液中，微波热修复抗原5 min，保温10 min，自然冷却；⑤PBS洗,3 min×2次；⑥滴加PD1抗体100 μl，置4 ℃冰箱12 h；⑦室温复温1 h，PBS冲洗3 min×2次；⑧滴加Maxvision二抗抗体，室温孵育1 h；⑨PBS冲洗3 min×2次；⑩DAB光镜下显色，出现棕色颗粒，停止显色，苏木精复染，封片。

1.4 判定标准

PD1在细胞质呈棕黄色颗粒沉着者为阳性。PD1染色结果根据阳性细胞 所占百分率进行半定量分析[1]，PD1根据显色癌细胞的比例记分：<1%为阴性，>1%者为阳性。阳性对照为北京中杉金桥生物技术有限公司的肺癌组织PD1蛋白阳性组织片，阴性对照：PBS代替一抗。

1.5 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行四格表卡方检验和R×C行列表检验分析。

2 结果

117例浸润性导管癌患者PD1阳性表达率为23.1%。PD1阳性表达率与乳腺癌脉管浸润和腋窝淋巴结转移情况呈显著性相关(P<0.05)，与患者年龄、组织学分级、肿瘤大小、肿瘤分子表型的ER、PR、CerBb-2的阳性结果及淋巴细胞浸润情况无显著性相关(P>0.05)，见表1。

表1 117例乳腺癌PD1表达与临床病理特征的关系

3 讨论

乳腺癌是女性高发肿瘤，根据2017年癌症统计中心数据，其排在女性肿瘤发病率的首位。三阴性乳腺癌的治疗效果较差，免疫治疗是近期乳腺癌规范治疗中的研究热点[2]。国内外研究进展表明PD1/PDL1信号在肿瘤免疫治疗中的作用在抗肿瘤免疫中，通常遵循肿瘤特异性T细胞活化、T细胞增殖、肿瘤浸润和T细胞记忆应答加强的步骤。研究表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的APCs表达的PDL-1均可经PD-1/PDL-1信号通路抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化，下调T细胞介导的肿瘤免疫应答[3]。本研究检测乳腺癌细胞的PD-1表达与其临床病理特征和其他相关分子表型的关系，为乳腺癌患者选择免疫治疗指标提供理论依据。

PD-1(programmed death-1)最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡-1基因，通过其配体形成PDL-1/PD-1通路发挥其生物学效应。PDL-1(B7-H1)属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PDL-1与其T细胞上的受体PD1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用；该分子具有广泛的组织表达谱，在一些肿瘤细胞系上有较高的表达，许多研究均表明其与肿瘤的免疫逃逸机制相关[4]。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PDL-1的表达，且表达广泛，表达的PDL-1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡[5]。转染PDL-1基因的P815肿瘤细胞系在体外可抵制特异性CTL的裂解，将其接种小鼠体内后具有更强的致瘤性和侵袭性。这些生物学特性均可通过阻断PDL-1而逆转。敲除PD1基因的小鼠，阻断PDL-1/PD-1通路，则接种肿瘤细胞不能形成肿瘤。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PDL-1蛋白的表达，且许多癌组织较正常组织中的PDL-1表达水平明显上调。在乳腺癌、胃癌、肠癌[5]、食管癌、卵巢癌、宫颈癌等人类肿瘤组织中检测到PDL-1蛋白的表达，且PDL-1的表达水平和患者的临床及预后紧密相关[6]。本研究中发现PDL-1蛋白的表达与乳腺癌的脉管浸润和淋巴结浸润密切相关，提示肿瘤组织表达PDL-1蛋白能够促使癌细胞的免疫逃逸，促进肿瘤的转移。本研究显示PD1表达与CerBb-2、ER与PR表达无关，在不同的乳腺癌亚型中无明显差异，但是与乳腺癌的浸润和转移能力密切相关，这与Muenst的研究结果一致，PD1是预后不良的因素。

国内外研究进展表明PD1/PDL1信号在肿瘤免疫治疗中的作用在抗肿瘤免疫中，通常遵循肿瘤特异性T细胞活化、T细胞增殖和T细胞记忆应答加强的步骤。研究表明，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的APCs表达的PDL-1均可经PD-1/PDL-1信号通路抑制肿瘤抗原特异性T细胞的活化，下调T细胞介导的肿瘤免疫应答。PDL-1单抗能有效抑制局部肿瘤生长；阻断PD-1/PDL-1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用；阻断肿瘤细胞上相关PDL-1信号可上调浸润CD8+T细胞IFN-γ的分泌，表明PD-1/PDL-1信号通路的阻断在以诱导免疫应答为目的的肿瘤免疫应答中发挥作用，特别是在基底细胞样乳腺癌[7]；与本研究发现有淋巴细胞浸润的乳腺癌PD1表达降低相一致，为乳腺癌的设计个体化综合治疗提供依据。