黑色素瘤癌组织中AQP1和AQP3表达水平与临床病理特征及预后不良的相关性

谢 群 胡 强 刘丹丹 山 超 杨 靖 张瑞瑞

黑色素瘤是1种具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤[1]。

水通道蛋白家族(aquaporins，AQPs)是水和小溶质运输的被动通道。近年研究显示，AQPs与不同类型疾病的发生有关，且AQPs在血管生成、细胞迁移和肿瘤生长中起重要作用[2-3]。研究证据表明，AQP1和AQP3参与皮肤角质形成细胞和内皮细胞等的迁移[4]。此外，AQP1和AQP3在不同类型的肿瘤中具有比在相应的正常组织中相对更高的表达水平[5]。本研究通过对80例接受手术治疗的黑色素瘤患者癌组织中AQP1和AQP3蛋白水平进行检测，旨在探讨两者与黑色素瘤的潜在关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2016年8月于湖北文理学院附属襄阳市中心医院整形美容科经病理学初次确诊的黑色素瘤患者80例，诊断标准依据美国抗癌联合会黑色素瘤指南第八版[6]。所有患者均经我科手术治疗，黑色素瘤和癌旁组织均置于-80 ℃冰箱储存。患者中位年龄为47岁，年龄32～64岁，平均年龄为(48.3±8.6)岁；男性55例，女性25例；Ⅰ期42例，Ⅱa期20例，Ⅱb期13例，Ⅲ期5例；高分化41例，中分化29例，低分化10例。纳入标准：①手术治疗前未接受其他治疗；②知晓本研究目的，并同意参与者；③最终配合研究人员完成随访者。排除标准：①已接受放化疗治疗者；②知晓研究目的后明确拒绝参与本研究者；③随访过程中的失访者。本项目经医院伦理会批准。

1.2 术后随访

术后对80例黑色素瘤患者进行30个月电话随访，随访日期截止至2019年2月，记录患者的生存时间。随访终点为：①30个月内死亡；②30个月随访结束。

1.3 免疫组织化学法检测及蛋白定量

所有组织样品均用4%甲醛固定，而后对样品进行脱水，石蜡包埋，切片。将切片室温封闭1 h(5%血清)，加入单克隆抗体AQP1和AQP3，碱性磷酸酶二抗4 ℃孵育(抗体购于Abcam公司)。分别加入链霉亲和素-过氧化物酶和二氨基联苯胺恒温显色封片。应用ImagePro Plus对免疫组化结果进行分析，并按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱评分(x×y)，x代表阳性细胞百分比：x=0，无阳性细胞；x=1，阳性细胞为1%～10%；x=2，阳性细胞为11%～50%；x=3，阳性细胞为51%～80%，x=4阳性细胞所占比例达81%以上。y代表阳性细胞染色强弱：y=0，阴性；y=1，弱阳性；y=2，中度阳性；y=3，强阳性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 黑色素瘤AQP1和AQP3免疫组织化学结果

与癌旁组织相比，黑色素瘤组织中AQP1和AQP3蛋白免疫组化评分均显著增高(P<0.05)，见表1。

表1 AQP1和AQP3蛋白的免疫组化评分

2.2 AQP1和AQP3蛋白免疫组化评分与黑色素瘤预后

共11例患者在30个月随访期间死亡。与低AQP1组相比，高AQP1组患者生存率显著降低(χ2=5.241，P=0.022，图1-A)；与低AQP3组相比，高AQP3组患者生存率显著降低(χ2=8.384，P=0.004，图1-B)。

图1 AQP1和AQP3蛋白免疫组化评分与黑色素瘤预后的分析

2.3 黑色素瘤组织AQP1和AQP3蛋白免疫组化评分与临床病理特征的相关性

依据AQP1和AQP3蛋白免疫组化评分中位数(AQP1：9分；AQP3：6分)，将80例患者分为高、低组。黑色素瘤组织中AQP1和AQP3蛋白免疫组化评分在患者不同年龄和性别间均无显著差异(P>0.05)，而分期越晚和分化程度越低患者的AQP1和AQP3免疫组化评分越高，见表2。且AQP1和AQP3水平与分期(AQP1：γ=0.543，P=0.001；AQP3：γ=0.562，P=0.002)和分化程度(AQP1：γ=0.516，P=0.002；AQP3：γ=0.497，P=0.007)呈显著线性关联，见表3。

表2 AQP1和AQP3免疫组化评分与黑色素瘤临床病理特征的关系/例

表3 AQP1和AQP3免疫组化评分与黑色素瘤临床病理特征的相关性分析

3 讨论

黑色素瘤最主要的特征是瘤体不受限制的生长及早期转移，具有高度侵袭性，但其相关机制尚不清楚。数据显示，其发病率在过去二十年间呈持续增高趋势。虽然大多数黑素瘤病例可接受手术切除原发肿瘤病灶，但该病的转移形式多样且患者预后不良[7]。此外，肿瘤细胞对治疗又具有高度抵抗性，最近报道指出，免疫抑制疗法在约60%的晚期黑色素瘤患者治疗中显示对疾病进程控制效果较差[8]，因此迫切需要找寻基于新靶标的更为有效的治疗策略。

近年研究发现，在皮肤组织真皮层中存在AQP蛋白家族。值得关注的是，在AQP蛋白家族中，AQP1和AQP3已在多个肿瘤中被证实参与肿瘤细胞的迁移与增殖[2-3,5]。Saadoun等[9]经皮下注射黑色素瘤细胞后，缺乏AQP1的小鼠由于肿瘤内新生血管形成受损而表现出肿瘤生长减弱，当从AQP+/+和AQP-/-小鼠中提取并培养主动脉内皮细胞时，与AQP+/+内皮细胞相比，AQP-/-内皮细胞对趋化性刺激的迁移活性较低。Korany等[10]发现，AQP3通过水和甘油转运调节角质形成细胞的迁移和增殖，并最终促进皮肤伤口愈合；此外，他们还发现由于皮肤表皮水合作用受损，缺乏AQP3的小鼠伤口愈合被延迟。上述研究均提示，皮肤中AQP1和AQP3表达在黑色素瘤生物学进展，特别是在肿瘤转移与侵袭等中有重要作用，进而影响患者预后。本研究通过运用免疫组织化学技术对80例经手术治疗的黑色素瘤组织标本内AQP1和AQP3水平进行检测，并对两者水平与患者预后间的关系进行分析。

本次研究我们发现，与癌旁组织相比，黑色素瘤组织中AQP1和AQP3蛋白免疫组化评分均显著增高；且分期越晚和分化程度越低的患者，其AQP1和AQP3免疫组化评分越高；相关性分析进一步提示，AQP1和AQP3水平与黑色素瘤高分期和低分化程度呈显著线性关联。上述研究提示，黑色素瘤患者癌组织中AQP1和AQP3的增高与患者肿瘤发展程度加深有紧密关系，且我们的研究结果与前期Saadoun等[9]和Korany等[10]的结果一致，AQP1和AQP3参与黑色素瘤细胞的恶性进展。上述发现在30个月的随访完成后得到了进一步的证实，组织中高AQP1与高AQP3患者的生存率均显著低于低AQP1与低AQP3者。我们的研究结果提示，对黑色素瘤患者组织中AQP1和AQP3蛋白定量对预后评估具有一定意义。然而，本研究有如下不足：①本研究尚缺乏一定的基础研究，对干扰黑色素瘤细胞系中AQP1和AQP3基因表达是否对细胞的生物学功能产生影响有待进一步分析；②关于外周血清中AQP1和AQP3蛋白的定量检测对黑色素瘤诊断和预后评估价值仍有待进一步探讨；③后期仍需加大样本量并扩大患者来源(我国的不同地区)以明确我们的研究结果。

综上所述，我们发现黑色素瘤癌组织中AQP1和AQP3表达增高与患者预后不良密切关联。