月见草油透皮吸收对小鼠体重增长抑制效果的研究

吴一仙，李依秋，周怡婷，张 革，曾 飒

(1.中山大学 药学院，广州 510006； 2.广州栋方生物科技股份有限公司，广州 510800)

人们由于缺乏规律的运动以及不健康的饮食，肥胖已经成为当今社会公共卫生问题之一。当前市面上有许多减肥药品，成分大致为左旋肉碱、奥利司他、氯卡色林等[1]。这些减肥药物虽然有效，但是也伴随有恶心、头疼、头晕、腹泻、油性大便等不良反应，影响人们的身体健康。寻找既有效又安全无副作用的减肥成分迫在眉睫。

月见草(Oenotheraspeciosa)是柳叶菜科草本植物，俗称夜来香，主要生长在北美洲东部的向阳处干燥沙地。月见草油来自低温压榨的月见草种子。月见草油呈淡黄色，约含有90%的不饱和脂肪酸，主要为含量约70%的亚油酸和8%～14%的γ-亚麻酸(GLA)[2]。GLA具有较强的生物活性，GLA在经过人体生理转换之后，会转变成为激素的前趋物质前列腺素(PGS)。PGS可以刺激棕色脂肪组织，通过粒腺体产生能量消耗、降低脂肪堆积[3-4]。据文献[5-6]报道，口服月见草油具有降血脂与降血糖的功效，可以显著降低肥胖大鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)的含量。

目前，月见草油已被广泛用于减肥保健品，大多为口服保健品，但会伴有腹泻副作用，故望改用外用涂抹后避免口服带来的副作用。作为外用减肥保健品，需其有良好的透皮吸收特征。研究表明，油酸与亚油酸是常见的协同透皮吸收促进剂[7]，并且γ-亚麻酸也展现了良好的透皮吸收特性[8]，这说明月见草油可以成为效果良好的外用减肥药。月见草油含有大量的不饱和脂肪酸，容易发生氧化导致油脂酸败[9]，为了提高其稳定性，需加入油脂抗氧化剂。常用的油脂抗氧化剂有黄酮类、多酚类、多糖类等[10]。橄榄油富含丰富的多酚类抗氧化剂[11]。在芳香疗法中，月见草油通常采用10%的剂量治疗皮肤病[12]。因此，本研究以5%月见草油与95%橄榄油调合成复方油进行实验。为验证月见草油经透皮吸收的减脂功效，以BALB/C小鼠作为实验动物模型，从小鼠体重增长幅度、体脂质量、脂肪系数、Lee’s指数、脂肪细胞、血脂生化指标以及肝脏脂肪代谢相关基因的表达水平方面，研究月见草油透皮吸收的预防肥胖效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料、试剂及仪器

月见草油购自河北家丰植物油有限公司，其基本指标见表1；橄榄油(Aladdin)；Trizol试剂(美国Invitrogen)；PrimeScriptTMRT反转录试剂盒(TaKara)；SYBR Premix Ex Taq II实时定量聚合酶链式反应试剂盒(TaKara)；PCR引物(上海生工)。

日立LABOSPECT003全自动生化分析仪；Nikon ECLIPSE 55i光学显微镜；电子天平，METTLER TOLEDO；4℃低温离心机，BECKMAN COULTER；CFX96 Touch荧光定量PCR仪，Bio-Rad公司；解剖手术器械；卷尺；无菌棉签；多聚甲醛。

表1 月见草油基本指标

1.1.2 实验动物

BALB/C小鼠，48只，雄性，6周龄，无特定病原体(SPF)级，平均体重(22±2)g。实验动物购自中山大学(实验动物中心东校区)，实验动物生产许可证号SCXK(粤)2016-0029。实验动物于屏障环境中饲养，饲料给予充足，实验期间动物房环境温度为23～25℃，相对湿度为50%～60%。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验

将48只BALB/C小鼠随机分成两组：月见草油组(实验组)、橄榄油组(对照组)，每组24只。实验时，取5 mL月见草油加入95 mL橄榄油中，配制体积分数为5%月见草油。将小鼠背部剃毛，测量体重与身长，每天定点给药1次，用量固定为每只小鼠0.2 mL，使用无菌棉签擦拭BALB/C小鼠背部，擦拭至棉签无油腻感。定期每周测量小鼠体重与身长。给药3周后，两组分别选8只小鼠眼球取血，颈椎脱臼处死，解剖取体脂(睾丸及肾周脂肪垫)。此后每隔1周进行以上操作，直至第5周。

1.2.2 指标观察与检测方法

中国石化销售有限公司广东肇庆分公司负责人向记者表示，该公司在肇庆开设了一个水上经营部共有7条水上加油船，自平安西江建设以来，在肇庆海事局的大力支持下，其公司积极配合，今年省公司专批了42万的费用下来，目前每条水上加油船都新设了交通艇和更新了围油栏，助力肇庆市水上突发溢油事件的应急处置。

1.2.2.1 体重、体脂测量与脂肪细胞大小观察

实验前，记录48只BALB/C小鼠的体重(g)与身长(cm)，实验开始后每周测体重与身长。计算Lee’s指数。Lee’s指数=(体重×103)1/3/身长。

解剖小鼠取其体脂，称重，储存于4%多聚甲醛中固定，并不时摇动，使脂肪固定完全、充分。石蜡包埋，切片后HE染色，光学显微镜观察脂肪细胞大小。切取脂肪均由同一个人操作，固定位置切取脂肪，减少操作误差。脂肪系数=体内脂肪质量/体重×100%。

1.2.2.2 血脂生化指标检测

小鼠眼球取全血，4℃下3 000 r/min离心15 min,分离血清待检测。测定血脂生化指标，包含血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)。

1.2.2.3 肝脏脂肪代谢相关基因表达水平检测

采用Trizol法提取肝脏总RNA，测定浓度后反转录得到cDNA，实时荧光定量PCR测定脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调节元件结合蛋白1C(SREBP1-C)、甘油三酯脂肪酶(HSL)、3-羧基-3-甲基戊二醛辅酶A还原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受体(LDL-R)和肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)的mRNA表达水平，以β-actin为内参，引物序列见表2。实时荧光定量PCR仪扩增条件设置为：95℃，5 min；95℃，30 s；55℃，30 s(40个循环)。最后根据Ct值对mRNA进行相对定量，采用2-ΔΔCt法计算。

1.2.3 统计学方法

实验数据处理均采用Excel 2010和SPSS 23统计软件进行方差分析，以“平均值±标准误差”表示。采用单因素方差分析，方差齐时组间比较采用LSD法，P<0.05 为差异有统计学意义。

表2 引物序列

2 结果与分析

2.1 月见草油对小鼠体重增长的影响

月见草油对小鼠体重增长的影响如图1所示。由图1可看出，橄榄油组小鼠体重上升较月见草油组显著，涂抹月见草油对小鼠体重增长有抑制作用，并在实验开始后4周与5周，两组小鼠体重有有统计学差异(P<0.05)。

注：*表示两组在P<0.05水平有统计学差异；**表示两组在P<0.01水平有统计学差异。下图同。

图1 小鼠体重增长趋势

2.2 月见草油对小鼠体脂质量的影响

月见草油对小鼠体脂质量的影响如图2所示。由图2可以看出，连续涂抹后，月见草油组与橄榄油组相比，小鼠的体脂质量明显下降，在涂抹月见草油4、5周后，有统计学差异(P<0.05)。

图2 小鼠体脂质量变化趋势

体脂质量、脂肪系数是反应肥胖程度的重要指标，Lee’s指数与人的体质量指数(BIM)类似，主要反应机体的肥胖程度。给药5周后，测定小鼠体重、体脂质量、脂肪系数及Lee’s指数，结果见表3。

由表3可以看出，连续涂抹5周后，月见草油组与橄榄油组相比，小鼠体重、体脂质量、脂肪系数、Lee’s指数均有统计学差异(P<0.05)。月见草油组小鼠的体重、体脂质量、脂肪系数与Lee’s指数均呈下降趋势。

表3 给药5周后小鼠体重、体脂质量、脂肪系数及Lee’s指数

注：*表示两组在P<0.05水平有统计学差异。下表同。

2.3 月见草油对小鼠脂肪细胞的影响

月见草油组和橄榄油组小鼠脂肪细胞的电镜图如图3所示。

注：A.橄榄油组(10×);B.橄榄油组(40×);C.月见草油组(10×);D.月见草油组(40×)。

图3 两组小鼠脂肪细胞

由图3可以看出，橄榄油组的小鼠脂肪细胞较月见草油组的小鼠脂肪细胞大，脂肪细胞里有明显脂滴，显微镜同视野范围内脂肪细胞的数量减少。说明月见草油能减少脂肪细胞内脂肪的累积，抑制脂肪细胞膨大。

2.4 月见草油对小鼠血脂生化指标的影响

月见草油对小鼠血脂生化指标的影响如表4所示。由表4可以看出：在给药3、4周后，月见草油组小鼠血清中TC、TG与橄榄油组相比，均有减少，但无统计学差异；在给药5周后，月见草油组小鼠血清TC、TG与橄榄油组相比，均有减少，且具有统计学差异(P<0.05)；在给药3、4周与5周后，月见草油组小鼠血清LDL与橄榄油组相比，明显减少，具有统计学差异(P<0.05)；月见草油组之间相比，随着给药时间延长，LDL的含量减少，且具有统计学差异(P<0.05)。

表4 月见草油对小鼠血脂生化指标的影响 mmol/L

注：#表示同组间在P<0.05水平差异显著。

2.5 月见草油对小鼠肝脏脂肪代谢相关基因mRNA表达水平的影响

在肝脏脂肪代谢途径中，固醇调节元件结合蛋白1C(SREBP1-C)是重要的核转录因子，其功能主要与下游一系列与脂肪合成相关基因有关，如激活乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)基因的表达[13]。ACC和FAS是催化脂肪酸合成的限速酶[14]。脂蛋白脂酶(LPL)、3-羧基-3-甲基戊二醛辅酶A还原酶(HMGCR)分别是TG和TC合成过程中的关键酶[15]。甘油三酯脂肪酶(HSL)是TG水解的关键酶[16]，低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因表达的上调可以降低血清LDL水平[17]，肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)是脂肪酸氧化的限速酶[18]。月见草油对小鼠肝脏脂肪代谢相关基因mRNA表达水平的影响如图4所示。

注：1.LPL；2.ACC；3.HMGCR；4.FAS；5.SREBP1-C；6.HSL；7.LDL-R；8.CPT1。

图4 两组小鼠肝脏脂肪代谢有关基因mRNA的相对表达量

由图4可以看出，在给药5周后，与橄榄油组相比，月见草油组的脂肪合成有关基因表达量均有下调，其中脂肪酸合成酶(FAS)mRNA、3-羧基-3-甲基戊二醛辅酶A还原酶(HMGCR)和固醇调节元件结合蛋白1C(SREBP1-C)mRNA有明显下调(P<0.05)，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA下调最为明显(P<0.01)，脂蛋白脂酶(LPL)mRNA下调无统计学意义。月见草油组的脂肪分解有关基因表达量均有上调，甘油三酯脂肪酶(HSL)、低密度脂蛋白受体(LDL-R)和肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)均有明显上调(P<0.01)。

3 结 论

本文以BALB/C小鼠作为实验动物，研究涂抹月见草油对小鼠体重增长幅度、体脂质量、脂肪系数、Lee’s指数、脂肪细胞、血脂生化指标以及肝脏脂肪代谢相关基因的表达水平的影响。结果表明，涂抹月见草油对小鼠体重增长有抑制作用，降低体脂质量，减少脂肪细胞内脂肪堆积，脂肪系数与Lee’s指数均下降，血清中TG、TC、LDL的含量显著下降。这可能是通过下调SREBP1-C，进而抑制下游有关脂肪合成基因ACC、FAS、LPL和HMGCR的表达，激活与脂肪分解相关基因HSL、CPT1和LDL-R的表达，进而抑制脂肪生成，促进脂肪分解，降低血脂含量。说明外用涂抹月见草油可以起到减脂、预防肥胖的效果。