糖尿病肾病家兔水通道蛋白及体素内不相干运动磁共振成像参数的研究

闫喜惠，刘艳波，王志强，郭 鹏

(1.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011；2.北华大学医学院，吉林 吉林 132013)

糖尿病是影响机体多个器官的全球性健康问题，可引起肾脏蛋白尿、肾病综合征，并最终导致肾功能衰竭[1].高尿葡萄糖水平会导致尿渗透压升高，从而降低肾脏对水的吸收，最终导致多尿[2].尽管持续的多尿可引起严重脱水，但是严重脱水在糖尿病患者中很少发生.因此，人们认为肾脏有一种减轻糖尿病脱水的补偿机制.AQP-1是调节跨细胞在细胞膜上运动的膜结合蛋白，在肾小管水的再吸收中具有至关重要的作用[3].

最近的一些研究[4-6]已经使用磁共振扩散加权成像方法来评价糖尿病肾病患者的肾功能，然而，表观扩散系数(ADC)很容易受到体内生理变化(如肾小管液体流动和血管内液体流动)的影响，磁共振IVIM成像可将真实扩散系数和各种灌注相关扩散系数区分开.另外，通过IVIM成像有助于揭示AQP的表达.

1 资料和方法

1.1 一般资料

所有实验均按照北华大学动物伦理委员会批准执行.45只雄性家兔分为对照组(n=15)、1型糖尿病组(n=15)、2型糖尿病组(n=15).1型糖尿病组家兔造模：150 mg/kg四氧嘧啶经耳缘静脉注射，4周后，血糖浓度≥16 mmol/L，入选1型糖尿病组.2型糖尿病组家兔造模：高脂高糖喂养，并将蔗糖按1 g/mL溶解于饮用水中，8周后，家兔血糖浓度≥16 mmol/L，入选2型糖尿病组.

1.2 磁共振检查方法

所有动物进行MRI检查，使用磁共振扫描仪(3.0T，GE Healthcare，Milwaukee，WI)和动物线圈，应用30 mg/kg戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉动物.扫描参数:冠状面扫描5层，层厚=2.5 mm，b=10，50，100，200，400，600，800，1 200 s/mm2，FOV=1 cm×16 cm，Tr=4 050 ms，TE=96.3 ms，NEX=2，TIME=6 mim 41 s.测量家兔肾皮质、外髓、内髓的SADC，D，D*值.

1.3 肾脏免疫组织化学

所有家兔在MRI后立即取肾组织样本，应用100 mg/kg戊巴比妥钠耳缘静脉注射，致家兔安乐死.用链霉亲和素-过氧化物酶技术对5 μm石蜡包埋组织切片，然后进行免疫组织化学染色.石蜡切片后进行分离、水化，并被抗原回收和内源过氧化物酶活性阻断.用AQP-1单克隆抗体(1/A5F6；1∶200；NOVUS，Littleton，CO，USA)在4 ℃下孵育一夜，然后与非生物素(ELVISIONTMSuperkit-9922，MAYXIN，中国福州)试剂a和b分别孵育15 min，使辣根过氧化物酶聚合物与原抗体结合.应用二氨基联苯胺染色，然后用苏木精染色.

分别拍摄每个肾脏3个解剖层的高分辨率图像(×400)，分析AQP-1染色，计算AQP-1染色所覆盖的区域.我们对OD值进行了3次测量，并对结果取均值.见图1.由图1可见，1型糖尿病组和2型糖尿病组肾皮质、外髓、内髓AQP-1免疫组化染色明显高于对照组.

图13组家兔肾皮质、外髓、内髓水通道蛋白-1 (AQP-1)免疫组化Fig.1Immunohistochemistry of renal cortex，outer med- ulla and inner medulla aquaporin-1 (AQP-1) of rabbits in three groups

1.4 统计学分析

2 结 果

1型和2型糖尿病组各参数之间无差异.与对照组比较，糖尿病家兔体质量减轻，血糖升高(P<0.001).统计分析结果见表1.糖尿病组中肾皮质、外髓、内髓真实扩散系数D值显著高于对照组；糖尿病组AQP-1在肾皮质、外髓、内髓中的表达明显高于对照组(统计分析结果见表1).真实扩散系数D值与肾皮质、外髓、内髓AQP-1表达的OD值呈正相关(见图2).肾皮质、外髓、内髓各解剖层都呈现显著正相关.

表1 3组家兔的特征Tab.1 Characteristics of rabbits in the three groups

图2水通道蛋白-1(AQP-1)表达的光密度(OD)值与真实扩散系数(D值)之间的相关性Fig.2Correlation between optical density (OD) values for aquaporin-1 (AQP-1) expression and pure molecular diffusion (D values)

3 讨 论

我们采用四氧嘧啶给家兔静脉注射诱导1型糖尿病模型，采用高脂肪高糖喂养的方法诱导2型糖尿病模型，结果这些动物出现了糖尿病的特征，如胰岛素分泌减少和代谢综合征症状[7].所有高脂饮食和四氧嘧啶处理的家兔均出现典型的高血糖、尿量增加和体质量减轻的糖尿病症状.

在糖尿病肾病的进展过程中，主要的病理变化包括纤维化、肾功能受损以及慢性肾脏疾病，所有这些都与ADC的降低有关[8].然而，在我们的研究中，1型和2型糖尿病组与对照组动物肾皮质、外髓、内髓的SADC，D*没有明显的变化，这些结果与CAKMAK等[9]的结果一致，对照组与糖尿病早期阶段之间的ADC没有显著差异.

IVIM磁共振成像参数D值有可能成为糖尿病肾病早期诊断的一种有前途的测定方法.此外，D值低于SADC值和D*值，这与扫描中b值越高、肾脏ADC越低的结论相一致[10].以往单指数模型得到的ADC值并不能真实反映组织的生理活动，因为它不仅包含有关扩散的信息，还包含灌注和流动效应的信息.D*值代表的扩散信号强度主要反应肾脏中的快速血液灌注情况.D值代表的扩散信号强度主要与水分子扩散有关.双指数模型公式：Sb/S0=(1-f)·exp(-b·D)+f·exp(-b·D*)，采用多b可以同时评价肾组织水分子真实扩散系数(D)和血流微循环灌注相关扩散系数(D*)，并将两者区分开来.根据D，SADC和D*扩散信号强度之间的关系，D值可能对较慢的扩散成分反应敏感，因为我们在本研究中观察到了真实扩散系数D值最低.此外，我们的结果表明：D值比SADC值和D*值对能量代谢或重吸收更敏感.

在最近的研究[11]中，ADC和AQP在细胞膜中表达之间的关系已经引起了人们的关注.一项使用磁共振扩散成像对帕金森病的临床研究表明：ADC可能有助于阐明AQP的功能.另外，水通道蛋白在膜中传输水的速度比细胞间隙间的水扩散速度慢0.45×10-3mm/s[12].水通道蛋白在肾脏的分布非常广泛，表达在肾近曲小管以及亨勒袢降支的质膜上，对肾小管水的再吸收起着重要的作用.而糖尿病患者渗透性利尿与肾脏水的调控有着重要的关系，AQP-1表达增加可能是一种减轻脱水的代偿机制.此外，我们的研究显示：D值的变化与AQP-1表达的变化呈正相关，但相关性有限.因此，基于这些发现，磁共振IVIM成像参数D值能够评估AQP-1对水的运输.

本研究存在一些局限性.首先，我们只测量了糖尿病模型的一个时间点.其次，样本量相对较少.

总之，与对照组相比，糖尿病组中肾皮质、外髓、内髓的D值和AQP-1的表达均明显增高(P<0.05).因此，我们认为AQP-1在缓解糖尿病合并多尿症引起的脱水方面具有重要作用，真实扩散系数D值的变化可以反映AQP-1的功能.