缺血预适应联合硒/丹参酮ⅡA对大鼠子宫再灌注损伤的影响

张爽 王冬

【摘要】 目的 研究缺血预适应联合硒/丹参酮ⅡA对大鼠子宫再灌注损伤的影响。方法 清潔级Wistar大鼠64只， 随机分为A组（模型组）、B组（预适应组）、C组（预适应+硒组）、D组（预适应+丹参酮ⅡA组）， 每组16只。四组大鼠均采用线栓法制备缺血再灌注损伤模型， 预适应组、预适应+硒组、预适应+丹参酮ⅡA组在造模前2 h、1 h和30 min各进行3个循环的缺血15 s+再灌注30 s。预适应+硒组在术前7 d起给予饮水中加入硒酵母片2～4 μg/（kg·d）， 预适应+丹参酮ⅡA组于术前7、5、3、1 d给予腹腔注射丹参酮ⅡA注射液20 mg/kg。缺血再灌注2 h取大鼠子宫组织， 利用分光光度计测量大鼠子宫组织匀浆中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）值， 免疫组化染色法（SABC）检测B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）蛋白表达， 并进一步行Western blot。结果 预适应组、预适应+硒组、预适应+丹参酮ⅡA组大鼠子宫组织中MDA、 SOD水平均低于模型组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）;预适应组与预适应+硒组大鼠子宫组织中MDA、 SOD水平比较差异无统计学意义（P>0.05）;预适应组、预适应+硒组大鼠子宫组织中MDA水平均高于预适应+丹参酮ⅡA组， SOD水平均低于预适应+丹参酮ⅡA组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。预适应组、预适应+硒组、预适应+丹参酮ⅡA组大鼠子宫组织中Bcl-2蛋白表达水平分别为（25.7±3.9）、（26.4±3.7）、（29.9±4.2）， 均高于模型组的（17.2±2.5）， 差异均具有统计学意义（P<0.05）;预适应组与预适应+硒组的大鼠子宫组织中Bcl-2蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）;预适应+丹参酮ⅡA组大鼠子宫组织中Bcl-2蛋白表达水平高于预适应组、预适应+硒组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论 缺血预适应、缺血预适应联合硒/丹参酮ⅡA对大鼠子宫缺血再灌注损伤具有保护作用， 且缺血预适+丹参酮ⅡA对其保护作用明显提高。

【关键词】 缺血预适应;缺血再灌注损伤;丹参酮ⅡA;硒;子宫组织;大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.28.112

【Abstract】 Objective   To study the effect of ischemic preconditioning combined with selenium/tanshinone ⅡA on uterine reperfusion injury in rats. Methods   A total of 64 clean Wistar rats were randomly divided into group A （model group）， group B （preconditioning group）， group C （preconditioning + selenium group）， and group D （preconditioning + tanshinone ⅡA group）， with 16 rats in each group. The models of ischemia-reperfusion injury were prepared by suture method in four groups of rats. The preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were performed for 3 cycles of ischemia 15 s+ reperfusion 30 s at 2 h， 1 h and 30 min before modeling. Preconditioning + selenium group was given 2～4 μg/（kg·d） of selenium yeast tablets in drinking water at 7 d before operation， and the preconditioning + tanshinone ⅡA group was given intraperitoneal injection of tanshinone ⅡA injection 20 mg/kg at 7， 5， 3 and 1 d before operation. Uterine tissue was taken from rats after 2 h of ischemia-reperfusion. The values of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） in rat uterine homogenate were measured by spectrophotometer， and the expression of Bcl-2 gene was detected by immunohistochemical staining （SABC） and further by Western blot. Results   The levels of MDA and SOD of uterine tissue in preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were lower that those in model group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in levels of MDA and SOD of uterine tissue in preconditioning group and preconditioning + selenium group （P>0.05）. The MDA level of uterine tissue in preconditioning group and preconditioning + selenium group was higher than that in preconditioning + tanshinone ⅡA group， and SOD level was lower than that in preconditioning + tanshinone ⅡA group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of Bcl-2 of uterine tissue in preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were （25.7±3.9）， （26.4±3.7） and （29.9±4.2） respectively， and those were all higher than （17.2±2.5） in model group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in expression level of Bcl-2 of uterine tissue between preconditioning group and preconditioning + selenium group （P>0.05）. The expression level of Bcl-2 of uterine tissue in preconditioning + selenium group was higher than those in preconditioning group and preconditioning + selenium group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion   Ischemic preconditioning and ischemic preconditioning combined with selenium/tanshinone ⅡA have protective effects on uterine ischemia-reperfusion injury in rats， and the protective effect of ischemic preconditioning + tanshinone ⅡA is obviously improved.

【Key words】 Ischemic preconditioning; Ischemia-reperfusion injury; Tanshinone ⅡA; Selenium; Uterine tissue; Rats

缺血再灌注损伤主要是指恢复缺血组织的血流灌注对组织造成的严重损伤， 而缺血预适应主要是指短暂缺血再灌可增强组织对随后较长时间缺血损伤耐受性的现象。国内外关于缺血再灌注损伤及缺血预适应的研究主要集中于心、脑、肾等重要组织器官[1， 2]。子宫是人体重要的生殖器官， 缺血再灌注损伤影响生殖功能。本课题组前期工作已完成子宫缺血再灌注损伤模型[3]， 并证实了中药丹参酮ⅡA[4]对子宫缺血再灌注损伤具有保护作用。本研究通过实验证实缺血预适、缺血预适应联合硒/丹参酮ⅡA对大鼠子宫缺血再灌注损伤具有保护作用， 且缺血预适+丹参酮ⅡA对其保护作用明显提高， 对临床工作提供实验室依据。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 实验材料 选用清洁级8周龄Wistar雌性大鼠64只， 体重178～246 g， 由吉林大学实验动物中心提供， 许可证号：SCXK（吉）2008-0005。随机分为模型组、预适应组、预适应+硒组、预适应+丹参酮ⅡA组， 每组16只。

1. 2 仪器和试剂 TD5A型凯达离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）， 电子精密天平（上海精密仪器仪表有限公司）， UV-755B型紫外可见分光光度计（上海巴玖实业有限公司）， 显微镜（上海医疗器械七厂）。BCl-2原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）， MDA测定试剂盒（北京雷根生物科技有限公司）， SOD活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。硒酵母片（牡丹江灵泰药业股份有限公司）， 丹参酮ⅡA（上海第一生化药业有限公司）。

1. 3 模型的制备 采用线栓法制备缺血再灌注损伤模型。各组大鼠造模前6 h禁食， 室温20～ 25℃， 用体积分数10%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠， 视大鼠角膜反射、是否有肌肉颤动等情况， 将大鼠维持一定的麻醉深度， 成功后， 将其仰卧固定， 于下腹部正中做一纵形切口， 长（5±1） cm， 并以切口下端为中点， 向两侧各延长1 cm， 形成一“⊥”形切口， 以便充分暴露大鼠子宫及邻近脏器， 将两侧腹壁组织外翻， 4-0丝线缝扎固定， 以避免遮挡视野， 增加手术时间， 用湿润棉签和眼科镊轻柔向上推离大鼠肠管， 暴露大鼠子宫， 大隐静脉注射50 U/kg肝素5 min后， 应用玻璃分针钝性分离大鼠腹腔动脉， 注意辨明髂腰动、静脉， 避免损伤致大出血， 在髂总动脉分叉处上方0.5 cm处用4-0丝线以方结结扎腹腔动脉， 剪断下腹壁两侧固定缝扎线， 以减少大鼠腹腔脏器水分的流失， 30 min后去除结扎线， 形成再灌注[3]。

1. 4 实验方法 除模型组外， 预适应组、预适应+硒组、预适应+丹参酮ⅡA组在造模前2 h、1 h、30 min各行3个循环的缺血15 s+ 再灌注30 s）。预适应+硒组在术前7 d起给予饮水中加入硒酵母片2～4 μg/（kg·d）， 预适应+丹参酮ⅡA组于术前7、5、3、1 d给予腹腔注射丹参酮ⅡA注射液20 mg/kg。采用线栓法建立大鼠子宫缺血再灌注损伤模型。再灌注2 h取大鼠子宫组织， 将子宫组织在冰冷生理盐水中漂洗干净， 除去血液， 滤纸拭干， 称质量后加入4℃的HEPES缓冲液中， 其体积是子宫组织块质量的9倍， 用玻璃匀浆器制成匀浆， 匀浆液以3000 r/min离心15 min， 取上清液， 70℃冰箱中保存备用。按试剂盒说明书， 利用分光光度计检测大鼠子宫组织的SOD、MDA水平。取大鼠子宫组织， 入4%多聚甲醛固定24 h， 常规石蜡包埋、脱水、切片， 厚5 μm， 小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体活性检测试剂， 参照免疫组化试剂盒说明书， 严格按照试剂盒操作步骤行免疫组织化学染色， 以磷酸缓冲盐溶液（PBS）代替一抗作阴性对照， DAB显色， 镜下观察显色， 苏木精轻度复染， 梯度脫水， 透明中性树胶封片。阳性判断：Bcl-2阳性为胞质及胞膜内侧出现黄至棕黄色颗粒， 每只大鼠取4张切片染色， 每张切片随机取5个高倍镜视野（×400）， 计数每个高倍镜视野内的阳性细胞数和细胞总数， 求其平均值， 并取大鼠子宫组织的匀浆样本进行 Western blot。目的蛋白的I抗稀释度为1︰400， 抗GAPDH的I抗稀释度为1︰6000， 4 ℃过夜。Ⅱ抗[山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）， 稀释度为1：2000]室温振荡孵育2 h， 洗涤后显影。采用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统对各条带的总灰度值作相对定量比较。

1. 5 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组大鼠子宫组织中MDA、SOD水平比较 预适应组、预适应+硒组、预适应+丹参酮ⅡA组大鼠子宫组织中MDA、 SOD水平均低于模型组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）;预适应组与预适应+硒组大鼠子宫组织中MDA、 SOD水平比较差异无统计学意义（P>0.05）;预适应组、预适应+硒组大鼠子宫组织中MDA水平均高于预适应+丹参酮ⅡA组， SOD水平均低于预适应+丹参酮ⅡA组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 各组大鼠子宫组织中Bcl-2蛋白表达水平比较 预适应组、预适应+硒组、预适应+丹参酮ⅡA组大鼠子宫组织中Bcl-2蛋白表达水平分别为（25.7±3.9）、（26.4±3.7）、（29.9±4.2）， 均高于模型组的（17.2±2.5）， 差异均具有统计学意义（P<0.05）;预适应组与预适应+硒组的大鼠子宫组织中Bcl-2蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）;预适应+丹参酮ⅡA组大鼠子宫组织中Bcl-2蛋白表达水平高于预适应组、预适应+硒组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表2。其Western blot检测结果见图1。