TET1蛋白对乳腺癌细胞株MDA-MB-453增殖的影响

陈舒颖 廖明 杨丽娜

【摘要】 目的 探讨TET1蛋白对乳腺癌细胞株MDA-MB-453增殖的影响。方法 将TET1的稳转细胞株（MDA-MB-453-TET1）和其阴性对照组稳转细胞株（MDA-MB-453-NC）通过慢病毒载体构建出来， 采用RNA的反转录（RT）-聚合酶链式反应（PCR）及蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测TET1的表达情况。细胞增殖实验（CCK-8法）检测细胞增殖;Western blot检测上皮间充质转化（EMT）相关蛋白[上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-链蛋白（β-catenin）]的呈现。结果 阴性对照组与空白对照组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表达水平比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1组E-cadherin（2.98±0.11）、TET1 mRNA（5.36±0.02）及TET1（12.3±0.41）均显著高于阴性对照组的（0.98±0.21）、（1.25±0.08）、（4.21±0.09）与空白对照组的（0.95±0.2）、（1.23±0.04）、（4.19±0.10）， N-cadherin（0.08±0.02）、Vimentin（4.41±0.18）、β-catenin（0.05±0.002）均低于阴性对照组的（0.10±0.01）、（9.98±0.52）、（0.11±0.02）与空白对照组的（0.11±0.02）、（9.97±0.45）、（1.23±0.04）， 差异均有统计学意义（P<0.05）。阴性对照组與空白对照组OD值比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1组OD值低于阴性对照组与空白对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。结论 TET1可抑制MDA-MB-453细胞增殖， 其机制可能与通过Wnt/β-catenin通路抑制EMT的发生相关。

【关键词】 乳腺癌;细胞株MDA-MB-453;TET1蛋白;细胞增殖

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.28.113

TET蛋白是存在于生物体内的一种双加氧酶， 其不但能使5-甲基胞嘧啶转变为5-羟甲基胞嘧啶， 同时还是DNA去甲基化过程中必不可少的一种酶， 这种酶在保持干细胞的多能性时也有着相当重要的用处[1]。该家族主要包括3种蛋白酶， 即TET1、TET2和TET3， 其中TET1蛋白参与肿瘤的增殖及侵袭转移过程[2]。通过体外实验研究TET1对乳腺癌细胞增殖能力的影响， 为研究乳腺癌的发生提供一定的参考。

1 材料与方法

1. 1 试剂 人乳腺癌细胞株MDA-MB-453与人胚肾HEK 293T慢病毒包装细胞（深圳市百恩维生物科技有限公司提供）;DMEM培养液（武汉普诺赛生命科技有限公司提供）;胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司提供）;Ⅱ型胶原酶（上海玉博生物科技有限公司提供）;胰蛋白酶及基质胶与Mdivi-1（上海玉博生物科技有限公司提供）;兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin一抗、羊抗兔荧光二抗、羊抗鼠荧光二抗均购自美国Sigma公司。

1. 2 方法 根据慢病毒的包装试剂外壳的使用说明来操作， 把转染的293T细胞培育72 h， 然后将培育中的清液收集起来， 即是慢病毒液。然后把感染靶细胞（MDA-MB-453）用嘌呤霉素做一次详细的挑选， 从中取得MDA-MB-453-TET1组和阴性对照组（MDA-MB-453-NC）;最后用未感染的细胞作为空白对照组。三组分别选取2×106个细胞进行分析， 对三组细胞进行增殖实验。

按照TET1试剂盒说明书进行操作。制备电泳胶， 将电泳胶放入电泳槽， 在聚合酶链式反应（PCR）热循环仪中将其逆转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参， 上游5'-GAAGTCACCCGCGTGCTAAT-3'， 下游5'-TCACTGCTCCCGAATGTCT-3';TET1上游5'-GTGTGATGAGCCCAAGGA-3'， 下游5'-GCAGTTGGCTCGCATCATAG-3'。PCR反应条件：在95℃10 min， 95℃50 s， 52℃50 s， 72℃3 min， 重复37个循环， 72℃延伸反应20 min， 计算TET1信使RNA（mRNA）水平相对表达量。

提取细胞总蛋白， 然后作十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）， 再转膜， 在其中添加对应一抗， 以4℃的温度放置一晚。第2天进行含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）漂洗， 加入二抗， 室温孵育2 h， 增强化学发光法（ECL）显色， 计算蛋白水平的相对表达量。

将对数生长期细胞， 按1×103个细胞的量加入到96孔板里面， 放入CCK-8后进行细胞培养， 时间的设定为0、12、24、36和72 h， 根据时间长短的排序依次放入CCK-8试剂10 μl/孔， 37℃、5%CO2细胞培养箱中过夜培养;酶标仪上检测各孔450 nm处的光密度（OD）值。这一实验过程最少要进行3次以上， 然后根据实验结果对实验数据作统计学分析和研究。

1. 3 观察指标 比较三组RT-PCR及Western blot法检测结果以及细胞增殖能力检测结果。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。所获数据均符合正态分布规律， 计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 三组RT-PCR及Western blot法检测结果比较 阴性对照组与空白对照组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表达水平比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1组E-cadherin、TET1 mRNA及TET1表达水平均显著高于阴性对照组与空白对照组， N-cadherin、Vimentin、β-catenin表达水平均低于阴性对照组与空白对照组， 差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 三组细胞增殖能力检测结果比较 阴性对照组与空白对照组OD值比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1组OD值低于阴性对照组与空白对照组， 差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

研究表明[3]， TET1可以调控DNA去甲基化， 参与肿瘤的侵袭和转移。EMT可导致肿瘤细胞离开原发部位， 经过血液循环或淋巴循环移动到其他地方。在这个过程中， 肿瘤细胞得到了间质细胞才有的迁徙能力， 这是由于肿瘤细胞的上皮型标志物E-cadherin的表达呈下降趋势， 间质型标志物Vimentin和N-cadherin的表达呈上升状态而导致的。大量研究表明， E-cadherin的启动子区域有超甲基化这一现象， 这也被视作是引起E-cadherin表达呈下降趋势的一大主要影响因素。TET1经过调整EMT相关蛋白的表达来影响乳腺癌的侵袭和移动[4-6]。

本研究中TET1在MDA-MB-453-TET1组出现高表达， 阴性对照组与空白对照组出现低表达， 说明MDA-MB-453-TET1的构建比较成功。MDA-MB-453-TET1细胞中E-cadherin表现是一种高表达， N-cadherin、Vimentin、β-catenin表现是一种低表达。实验表明， TET1能经过调节EMT影响乳腺癌的侵袭和移动， 然后经过推进乳腺癌细胞向上皮样表型转化， 提高E-cadherin的表达增强细胞间的黏附能力， 最终使N-cadherin、Vimentin和β-catenin減少， 从而抑制EMT发生。CCK-8法进行检测乳腺癌细胞株增殖能力实验中， 在接种细胞24、36、72 h后MDA-MB-453-TET1组的细胞生长速度明显减慢。说明TET1的过表达抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞的增殖。

综上所述， TET1可抑制MDA-MB-453细胞增殖， 其机制可能与通过EMT相关蛋白通路抑制EMT的发生相关。

参考文献

[1] 段红洁， 张爱民， 牛秀珑， 等. IFN-γ和IL-4对人乳腺癌细胞系MCF-7成瘤性、黏附能力的影响及其机制. 中国肿瘤生物治疗杂志， 2015， 22（5）：597-602.

[2] Chen HF， Wu KJ. Epigenetics， TET proteins， and hypoxia in epithelial-mesenchymal transition and tumorigenesis. BioMedicine（Taipei）， 2016， 6（1）：1-8.

[3] Huang Y， Chavez L， Chang X， et al. Distinct roles of the methylcytosine oxidases Tet1 and Tet2 in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111（4）：1361-1366.

[4] 张萌萌， 李雅琪， 张硕， 等. TET1蛋白对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株增殖和侵袭能力的影响及其相关机制. 肿瘤防治研究， 2017， 44（7）：447-453.

[5] Jeschke J， Collignon E， Fuks F. Portraits of TET-mediated DNA hydroxymethylation in cancer. Curr Opin Genet Dev， 2016， 36（36）：16-26.

[6] Yang H， Liu Y， Bai F， et al. Tumor development is associated with decrease of TET gene expression and 5-methylcytosine hydroxylation. Oncogene， 2013， 32（5）：663-669.

[收稿日期：2019-03-06]