不同比例甘草配伍对山豆根水煎剂中有毒生物碱含量的影响

李海燕，钟 妤，钟多敏

（佛山科学技术学院药学系，广东佛山528000）

山豆根收载于2015版中国药典，为豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根和根茎，其性苦、寒并有毒，具有清热解毒、消肿利咽的功效，用量为3～6 g，苦参碱和氧化苦参碱是质量控制的指标成分[1]。

随着山豆根在临床上的广泛使用，其所致肝毒性的不良反应亦日益增多[2]。有研究发现，山豆根水煎液会对大鼠造成肝损害[3-4]。山豆根中的苦参碱和氧化苦参碱是引起毒性反应的主要成分，超剂量服用是中毒的主要原因[5]。在以山豆根治疗急性咽喉炎、扁桃腺炎及扁桃体化脓等疾病有中毒反应的病例中，用量10 g以上者，半数以上出现毒性反应[6]。苦参碱和氧化苦参碱这两种成分的毒性，又以氧化苦参碱的毒性较低[7]。中药配伍是中医临床用药的一大特色。传统中药方剂中，常以甘草配伍诸药，水煎煮成汤剂后服用，以缓解药物毒性。

近年来，有文献报道，甘草能明显减轻山豆根造成的肝损害，且以山豆根与等量或大于山豆根剂量的甘草的配伍比例减毒效果较好[6，8-9]。但鲜见关于甘草配伍山豆根对其水煎剂中有毒生物碱成分影响的研究。本实验采用高效液相色谱法，测定甘草与山豆根不同配伍比例（0∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1）水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱的含量，了解甘草配伍对山豆根水煎剂中毒性成分的影响，为降低山豆根毒性及其临床安全用药提供理论依据和指导。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DZTW电热套（北京市永光明医疗器械有限公司）；FA2004B分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；TDL-50B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；PS-D30A超声波清洗机（东莞洁康设备有限公司）；EYELAA1000S旋转蒸发仪（配有CA-1111密闭式冷却水循环装置，东京理化器械株式会社）；Sartorius赛多利斯CPA225D天平（北京东南仪诚实验室设备有限公司）；岛津LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 材料

甘草药材饮片（批号：171001，产地内蒙古）；山豆根药材饮片3批（批号：HX15F01，产地广东；批号：20160402，产地云南；批号：20150701，产地广西），均为市售药材。苦参碱对照品（批号110805-200508，供含量测定用，中国食品药品检定研究院），氧化苦参碱对照品（批号110780-200506，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）。其他试剂包括：水为超纯水，乙腈、甲醇、无水乙醇（均为色谱纯），均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取苦参碱对照品0.010 53 g，置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为0.210 6 mg/mL的苦参碱对照品储备液；精密称取氧化苦参碱对照品0.015 05 g，置于20 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为0.752 5 mg/mL的氧化苦参碱对照品储备液。精密吸取苦参碱、氧化苦参碱对照品储备液，加甲醇配成质量浓度为21.06 μg/mL苦参碱、150.5 μg/mL氧化苦参碱的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

2.1.2.1 山豆根水煎剂溶液的制备

称取山豆根药材25 g，加5倍量水浸泡60 min，加热煮沸后，保持微沸煎煮30 min，过滤；药渣再加入3倍量水，再煎煮30 min，过滤。合并两次滤液，置离心机中，3 000 r/min离心20 min，倒出上清液，旋转蒸发仪浓缩至生药量1 g/mL，4℃冷藏，备用。

2.1.2.2 山豆根配伍甘草水煎剂溶液的制备

分别称取山豆根药材 25 g，按甘草与山豆根的配伍比例（0.5∶1、1∶1、2∶1），分别加入甘草，按 2.1.2.1方法制备，旋转蒸发仪浓缩至生药量1 g/mL，4℃冷藏，备用。

2.1.2.3 试品溶液的制备

精密量取上述水煎剂溶液0.5 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷-甲醇-浓氨（40∶10∶1）混合溶液50 mL，密塞，称定重量，放置30 min，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，再称定重量，用三氯甲烷-甲醇-浓氨混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液10 mL，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取出滤液，即得[1]。

2.2 色谱条件

采用Agilent（ZORBAX NH2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10）为流动相[10]，流速 0.80 mL/min，柱温 35.0 ℃，检测波长 210 nm，进样体积 5 μL。

2.3 线性关系考察

分别吸取苦参碱对照品储备液0.5、1、2、2.5、3 mL置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，各取5 μL，进样检测。分别以峰面积为纵坐标（Y），生物碱浓度为横坐标（x）进行线性回归，得回归方程

分别吸取氧化苦参碱对照品储备液0.2、0.6、0.8、1、2 mL置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，各取5 μL，进样检测。分别以峰面积为纵坐标（y），生物碱浓度为横坐标（x）进行线性回归，得回归方程

苦参碱在10.53～63.18 μg/ml、氧化苦参碱在15.05～150.5 μg/ml浓度范围内表明线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液5 μL，按2.2项下色谱条件连续进样5次，测定峰面积，结果苦参碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为0.95%、1.03%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

称取同一批次山豆根药材饮片6份，各25 g，按2.1.2.1、2.1.2.3方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液5 μL，按2.2项下色谱条件进样，测定峰面积，计算含量，结果显示苦参碱、氧化苦参碱的RSD分别为1.32%、1.97%，表明检测方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

称取山豆根药材饮片25 g，按2.1.2.1、2.1.2.3方法制备供试品溶液，精密吸取待测供试品溶液，按2.2项下色谱条件，分别于配制0、1、4、8、12 h依次进样5 μL，测定峰面积，计算含量，结果显示苦参碱、氧化苦参碱的RSD分别为1.83%、2.01%，表明供试品溶液在12 h内稳定性好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的同一批次山豆根水煎剂溶液6份，精密吸取0.25 mL，分别精密加入适量的苦参碱、氧化苦参碱对照品，按2.1.2.3方法制备加样回收试验样品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，计算结果显示，加样回收率符合方法学考察规定，苦参碱、氧化苦参碱平均回收率分别为98.95%、101.81%，RSD分别为2.16%、2.27%。

2.8 样品测定

分别取3批山豆根药材饮片，同一批甘草药材饮片，分别按2.1.2.3方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，按2.2项下色谱条件进样分析，测定供试品中苦参碱、氧化苦参碱含量，结果详如表1、图1和2所示。

表1 不同比例甘草配伍3批山豆根水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定结果（，n=2）

表1 不同比例甘草配伍3批山豆根水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定结果（，n=2）

注：表1中，*表示甘草：山豆根（0∶1）组与各组之间在0.01水平存在显著差异；[↑]表示各组与甘草、山豆根比例（0∶1）组比较含量升高；[↓]表示各组与甘草、山豆根比例（0∶1）组比较含量降低。

山豆根批号 产地甘草与山豆根比例 苦参碱/% 氧化苦参碱/% 苦参碱和氧化苦参碱总量/%HX15F01广东0∶1 0.5∶1 1∶1 2∶1 0.232 2 0.224 7*[↓3.23%]0.233 2[↑0.43%]0.234 7[↑1.08%]0.610 4 0.432 4*[↓29.16%]0.433 3*[↓29.01%]0.296 7*[↓51.39%]0.842 7 0.657 1*[↓22.02%]0.666 5*[↓20.91%]0.531 4*[↓29.16%]20160402云南0∶1 0.5∶1 1∶1 2∶1 0.280 3 0.278 3[↓0.71%]0.314 3*[↑12.13%]0.297 4*[↑6.1%]0.379 7 0.281 3*[↓25.92%]0.306 2*[↓19.36%]0.204 7*[↓46.09%]0.660 0 0.559 5*[↓15.23%]0.620 5*[↓5.98%]0.502 1*[↓23.92%]20150701广西0∶1 0.5∶1 1∶1 2∶1 0.293 9 0.339 1*[↑15.38%]0.530 8*[↑80.61%]0.280 5*[↓3.58%]1.066 6 1.113 1*[↑4.36%]1.046 2*[↓1.91%]0.404 4*[↓62.09%]1.360 5 1.452 3*[↑6.75%]1.577 0*[↑15.91%]0.685 0*[↓49.65%]

2.8.1 色谱峰归属

由图1可知，苦参碱、氧化苦参碱均能得到良好分离，空白溶剂无干扰。产地云南、批号20160402的山豆根样品溶液色谱，在氧化苦参碱成分旁边出现1个肩峰，而另外两批次和产地的山豆根样品则无此肩峰出现。3批山豆根样品溶液色谱中苦参碱、氧化苦参碱的峰高、峰面积均有差异。

图1 供试品及混合对照品色谱

图2 不同比例甘草配伍3批山豆根对水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱含量的影响

2.8.2 不同比例甘草配伍3批山豆根水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱的含量

表1中每份样品均设2个平行，所得数据应用SPSS17.0软件进行统计分析。

由图1、表1可知，3批山豆根药材饮片水煎剂中均含有苦参碱、氧化苦参碱，总量均符合2015版中国药典中对山豆根饮片含量标准规定（不得少于0.60%）。但产地批次不同，其含量均存在差异。其中批号为20150701广西产山豆根中苦参碱、氧化苦参碱的含量均最高，苦参碱和氧化苦参碱总量1.360 5%，超出2015版药典要求的1.267 5倍；批号为20160402云南产山豆根中氧化苦参碱的含量、苦参碱和氧化苦参碱总量均最低；批号为HX15F01广东产山豆根中苦参碱的含量最低。

不同比例的甘草配伍山豆根（0.5∶1、1∶1、2∶1）后，广东、云南产山豆根水煎剂溶液中，氧化苦参碱的含量、苦参碱和氧化苦参碱的总量与甘草、山豆根比例（0∶1）组比较，均显著降低（p＜0.01），其中（2∶1）组中苦参碱和氧化苦参碱的总量已低于2015版中国药典中对山豆根饮片含量标准规定（不得少于0.60%）；苦参碱的含量与甘草、山豆根比例（0∶1）组比较，（0.5∶1）组均降低，（1∶1）组和（2∶1）组均升高，其中广东产山豆根（0.5∶1）组均显著降低（p＜0.01），云南产山豆根（1∶1）组和（2:1）组显著升高。而不同比例甘草配伍广西产山豆根后，其水煎剂溶液中，苦参碱的含量、氧化苦参碱的含量、苦参碱和氧化苦参碱的总量与甘草、山豆根比例（0∶1）组比较，（0.5∶1）组均显著升高（p＜0.01），（2∶1）组均显著降低（p＜0.01）。

2.8.3 不同比例甘草配伍3批山豆根对水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱含量的影响

由图2、表 1 可知，不同比例甘草配伍广东、云南产山豆根（0∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1）对水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱含量的影响趋势相近。加入甘草为山豆根的半量（0.5∶1）后，显著降低氧化苦参碱的含量、苦参碱和氧化苦参碱的总量，广东产山豆根水煎剂中苦参碱含量显著下降，云南产山豆根水煎剂中苦参碱含量略有下降；加入甘草为山豆根的等量（1∶1）后，氧化苦参碱的含量、苦参碱和氧化苦参碱的总量较无甘草组（0∶1）显著降低，而较（0.5∶1）组却略有回升，苦参碱含量较无甘草组（0∶1）升高；当加入甘草为山豆根的倍量（2∶1）后，苦参碱含量较无甘草组（0∶1）升高，氧化苦参碱的含量、苦参碱和氧化苦参碱的总量下降的幅度最大，其中苦参碱和氧化苦参碱的总量小于0.60%，低于2015版中国药典对山豆根药材饮片质量标准的最低要求。

广西产山豆根水煎剂溶液中含有的苦参碱和氧化苦参碱总量较高，是2015版中国药典对山豆根药材饮片质量标准的最低要求（不低于 0.60%）的 2.267 5 倍，加入（0.5∶1、1∶1、2∶1）比例甘草配伍后，对其水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱含量的影响趋势与广东、云南产山豆根不同。加入甘草为山豆根的半量（0.5∶1）后，苦参碱含量、氧化苦参碱含量、苦参碱和氧化苦参碱总量均显著升高；加入甘草为山豆根的等量（1∶1）后，氧化苦参碱含量显著降低，但苦参碱含量、苦参碱和氧化苦参碱总量仍然显著升高，且苦参碱的含量较（0∶1）组升高了80.61%；当加入甘草为山豆根的倍量（2∶1）后，苦参碱含量、氧化苦参碱含量、苦参碱和氧化苦参碱总量均显著降低，氧化苦参碱含量下降了62.09%，苦参碱和氧化苦参碱总量略高于2015版中国药典对山豆根药材饮片质量标准的最低要求。

3 讨论

山豆根中含有生物碱、槲皮素、多糖等多种活性成分[11]，其中苦参碱和氧化苦参碱既是有效成分[1，12-13]，又是毒性成分[14]。目前对于山豆根药材的功效、毒性和物质基础3者之间的关联性尚不完全明确。临床用药时，如何能够有效达到增效减毒的安全用药目的，具有极其重要的意义。

本次实验建立HPLC法测定山豆根饮片水煎液中苦参碱、氧化苦参碱的含量，以乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10）为流动相，检测波长为210 nm，流速为0.8 mL/min，柱温35.0℃为色谱条件，方法学考察结果表明，该方法准确、重现性好。摸索色谱条件过程中，比较和调整了流动相的流速，当流速为0.8 mL/min时，基线平稳，成分分离效果好。

山豆根药材中生物碱的含量与药材的产地[15]、生长年限[16]等因素相关，本实验测定3批不同产地山豆根饮片水煎剂溶液中苦参碱和氧化苦参碱的含量，结果苦参碱和氧化苦参碱总量均符合药典标准，其含量的由高到低顺序为广西、广东、云南。由于广西产山豆根饮片水煎剂中苦参碱和氧化苦参碱总量是药典标准最低限的2.267 5倍，提示即使在药典3～6 g的规定安全用量范围内，仍存在较大的产生不良反应及中毒风险。

在植物体内或中药复方中，由于加热煎煮、药物配伍、还原性物质的存在等因素的影响，苦参碱和氧化苦参碱两者之间存在氧化还原的动态变化[17-19]。本研究比较不同比例甘草配伍对山豆根与水煎剂中苦参碱、氧化苦参碱含量的影响，结果显示：1）广西产的山豆根药材，当配伍等量甘草（1∶1）时，其水煎剂中含有的苦参碱含量升高了80.61%，其余2批山豆根药材按此比例配伍后，苦参碱含量也略有升高，聂安政[20]认为苦参碱是引起山豆根毒性反应的主要化学物质，张宏利等[21-22]、戴五好等[23]通过对小鼠的药理活性实验得出苦参碱毒性大于氧化苦参碱的结论，提示在以苦参碱和氧化苦参碱的总量为检测指标的同时，应该注意密切监测苦参碱的含量变化。2）不同产地、药效成分含量差异明显的3批山豆根药材饮片，当加入倍量甘草配伍后（甘草与山豆根2∶1），其水煎剂溶液中氧化苦参碱的含量、苦参碱和氧化苦参碱的总量均能够显著降低，与潘双凤[6]等发现甘草与山豆根以2∶1比例配伍使用时降低山豆根致小鼠肝损伤程度效果更佳的药理实验结果相一致，为山豆根的临床安全使用提供关于物质基础的有效实验参考依据。