循环miRNA-21 与肌钙蛋白T 联合检测对急性心肌梗死早期诊断的应用价值

杨捍卫，唐忠志，郝 谦

随着人口老龄化到来，因胸痛发作的急诊病人逐渐增多。有研究报道，每年有超过1 000 万美国人因胸痛而急诊就诊［1］。急性冠脉综合征( acute coronary syndrome，ACS) 是胸痛的常见原因，因ACS 急诊住院病人逐渐增多，给病人家庭和国家带来巨大的财政负担［2］。若有快速、敏感和特异性高的生物标志物鉴别ACS 的不同疾病及其他导致胸痛的原因( 如胃食管反流) ，可给予及时有效治疗［3］，早期诊断急性心肌梗死( AMI) 对减轻心肌损伤和保护心脏功能具有重要临床意义。

目前AMI 的早期诊断主要基于临床症状、体格检查、心电图、肌钙蛋白( cTn) 和心肌酶谱水平［4］。cTn通常在发病4～6 h 开始升高，因此连续监测cTn 变化对大多数急性胸痛病人是不可或缺的。然而检测心肌cTn 水平对区分AMI 和其他疾病不是非常敏感且具有特异性，非致死性胸痛也会出现cTn 水平增高［5］，因此，需要灵敏性和特异性更高的新型生物标志物早期AMI 诊断。

微小RNA( miRNA) 是由约22 个核苷酸组成的、小的、高度保守的非编码RNA 分子。miRNA 通过抑制靶基因的信使RNA 翻译或通过促进mRNA 降解调节基因表达。有证据表明，miRNA 在许多生物过程中起重要作用，包括增殖、分化和凋亡，它们涉及各种类型心血管疾病［6］。许多miRNA 在血浆和其他体液中比较稳定且易于检测，且循环miRNA 水平在特定的生理和病理条件下变化，表明循环miRNA 是AMI 的理想生物标志物［7］。已有研究表明，梗死心肌中miR-1、miR-133、miR-499 等 miRNA 水平降低，血浆 miRNA 升高，表明循环中 miRNA 从梗死心脏中释放［8］。AMI 后血浆miRNA 水平升高反映心肌损伤。田志鹏等［9］研究发现，AMI 病人全血miRNA-1 表达水平明显增高，且与血浆cTnI 表达水平比较具有更早的时间窗和到达峰值时间，具有诊断AMI 良好的早期敏感性。有研究表明，miRNA-21 在大鼠心肌梗死后交界区组织中表达上调，参与调控心肌梗死后心室重构［10-11］。因此可能作为心肌损伤的潜在生物标志物。miRNA-21 对AMI 可能具有一定的诊断价值，但需要更多研究证据证实。目前有关miRNA-21 在AMI 病人的表达水平及临床意义尚不清楚。本研究通过检测AMI 病人血浆miRNA-21 和肌钙蛋白T( cTnT) 水平变化，进一步探讨miRNA-21 在AMI 早期诊断中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2015 年 4 月—2016 年 12 月因急性胸痛发作6 h 内于急诊就诊的病人138 例，均行冠状动脉造影术，确诊 AMI 病人 85 例( AMI 组) ，不稳定型心绞痛病人53 例( UAP 组) ，另选取同期在本院体检中心体检健康者30 名作为对照组。3 组一般资料比较，差异无统计学意义( P ＞0.05) ，具有可比性。详见表1。

表1 各组一般资料比较

1.2 纳入与排除标准 纳入标准: 有胸痛症状，发病6 h 内; 心电图、心肌标志物或心肌酶谱等指标符合2007年美国心脏协会( AHA) /美国心脏病学会( ACC) 制定的心肌梗死标准［12］; 冠状动脉造影检查显示1 支及以上冠状动脉血管狭窄超过50%; 经医院伦理委员会批准，病人自愿参加，并签署知情同意书。排除标准: 因急性创伤引起的胸痛; 肺栓塞、主动脉夹层等引起的胸痛; 合并肝肾功能不全、心脏瓣膜病、急性感染、血液系统疾病、恶性肿瘤等。

1.3 冠状动脉造影检查 由专业心血管介入医师行冠状动脉造影术。采用标准Judkins 法，常规投照体位行左、右冠状动脉造影。Gensini 评分是评估冠状动脉粥样硬化严重程度的评分系统［13］。1% ～25%管腔狭窄计 1 分，26% ～50%管腔狭窄计 2 分，51% ～75%管腔狭窄计 4 分，76% ～90%腔狭窄计 8 分，91% ～99%管腔狭窄计16 分，完全狭窄计32 分。Gensini 评分越高说明狭窄程度越严重。

1.4 观察指标

1.4.1 cTnT 检测 病人在急诊即刻抽取静脉血，健康体检者于体检当日早晨采集空腹静脉血。cTnT 采用全自动电化学发光免疫分析仪( Elecsys 2010，Roche 公司) 进行测定。以 cTnT＜0.04 ng /mL 为正常参考值，cTnT＞0.1 ng /mL 为有临床意义，cTnT＞0.5 ng /mL 为AMI 诊断参考值。

1.4.2 miRNA-21 检测 病人在急诊即刻抽取静脉血，健康体检者于体检当日早晨采集空腹静脉血。具体步骤: 采集静脉血后，加入到乙二胺四乙酸( EDTA) 处理的抗凝血管中，以3 000 r/min 离心10 min 后分离血浆，之后再以12 000 r/min 离心10 min 分离血浆，置于无RNA 酶的 Ep 管中，－80 ℃保存，集中待测。RNA抽提: 取400 μL 血浆加入到等体积TRIzol 中，在冰上放置5 min 后，加入800 μL 氯仿，并在冰上孵育5 min。4 ℃条件下，以 12 000 r/min 离心 10 min 后，收集上清液。按照 mirVana PARIS 试剂盒说明书( Ambion 公司，美国) 分离总RNA。通过用RNase Free 水洗涤，收集总 RNA( 100 μL) ，之后使用 NanoDrop ND-1000 核酸定量检测仪检测RNA 浓度和纯度( NanoDrop 公司，美国) 。qRT-PCR: 按照TaqMan microRNA 逆转录试剂盒说明书( Ambion 公司，美国) 进行逆转录，定量检测血浆样品中 miRNA。将含有 5 μL RNA 提取物、0.15 μL dNTPs( 100 mmol/L) 、1 μL Multi Scribe RT 酶( 50 U/μL) 、1.5 μL 10×RT-PCR 缓冲液，0.19 μL RNA 酶抑制剂( 20 U/μL) ，1 μL 基因特异性引物( miR-21，Catalog number: 0397 和 U6 snRNA，Catalog number: 1973，由上海生物工程有限公司合成) 和4.16 μL 无核酸酶水加入到反转录系统中。反转录反应条件为16 ℃温育 30 min，42 ℃温育 30 min，85 ℃温育 5 min，然后保持在 4 ℃。qPCR 系统( 20 μL) 包括 10 μL TaqMan 2×Universal PCR 主混合物( 美国应用生物系统公司) 、1 μL 基因特异性引物( 终浓度 200 nmol/L) 和 7.67 μL无核酸酶扩增总共 1.33 μL cDNA，最终体积为 20 μL。qPCR 在7300 实时PCR 系统( 美国应用生物系统公司) 上进行，反应条件为95 ℃下孵育10 min，随后40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。使用 2－ΔΔCT方法计算相对表达水平，使用U6 作为miRNA-21 表达的内部对照。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差( x±s ) 表示，采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法; 计数资料采用χ2检验，指标之间的相关性采用Pearson 相关分析; 利用ROC 曲线评价各指标诊断AMI 能力。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组循环miRNA-21、cTnT 水平比较 单因素方差分析结果显示，各组循环miRNA-21、cTnT 水平差异有 统 计 学 意 义 ( F 值 分 别 为 214 . 67 ，160 . 96 ，P ＜0.01) ; 进一步两两比较，与对照组比较，AMI 组和 UAP组循环 miRNA-21、cTnT 水平明显升高( P ＜0. 01) ;AMI 组循环 miRNA-21、cTnT 水平明显高于 UAP 组( P＜0.01) 。详见表 1。

表1 各组miRNA-21 和cTnT 水平比较( x ±s )

2.2 Gensini 评分与循环 miRNA-21、cTnT 水平的相关性分析 Pearson 相关性分析结果显示，AMI 组和UAP组 Gensini 评分与循环 miRNA-21、cTnT 水平均呈 正 相 关 ( r = 0 . 8 0 5 ，P = 0 . 0 0 0 ; r = 0 . 6 5 3 ，P =0 .000) ; 循环miRNA-21与cTnT水平呈正相关( r =0.801，P = 0.000) 。详见图 1～图 3。

图1 Gensisni 评分与循环miRNA-21表达水平的相关性分析

图2 Gensisni 评分与cTnT 水平的相关性分析

图3 miRNA-21 表达水平与cTnT 水平的相关性分析

2.3 循环 miRNA-21、cTnT 早期诊断 AMI 应用价值应用ROC 曲线分析循环 miRNA-21、cTnT 早期诊断AMI 的价值，miRNA-21 的 ROC 曲线下面积( AUC) 为0 . 957 ( 95 % CI : 0 . 908 ～ 0 . 984 ，Z = 28 . 083 ，P =0.000) ，miRNA-21 ＞7.12 时，敏感度为 91.76%，特异度 为 9 4 . 3 4 %; cTnT 的 ROC 曲 线 下 面 积 ( AUC ) 为0.877( 95%CI : 0.810 ～0.927，Z = 13.342，P = 0.000) ，cTnT＞0.82 ng /mL 时，敏感度为 87.06%，特异度为 71.70%; 联合检测 miRNA-21、cTnT 对 AMI 诊断价值比较，联合检测 AUC 为 0.973( 95%CI : 0.952 ～ 0.994，Z= 3.334，P = 0.000) ，敏感度为 92.9%，特异度为 95.2%。详见图4。

图4 循环miRNA-21 和cTnT水平早期诊断AMI 的ROC 曲线

3 讨 论

由于冠状动脉急性闭塞，导致心肌缺血，造成心肌细胞死亡。目前认为循环cTnT 和 cTnI 是早期诊断AMI 的经典生物标志物。AMI 是一个复杂过程，涉及到多种基因参与调节。miRNA 是调节心肌细胞30%以上基因的基因调控者，miRNA 可能参与AMI 的发病过程。已有研究证实，在梗死边缘和梗死区域的早期阶段( 6 h) 多种 miRNA 异常表达［14］。因此，探讨具有高特异性和灵敏度的早期诊断AMI 的新型生物标志物是非常必要的。

有研究表明，miRNA-21 参与心肌梗死的发病过程。Zhang 等［15］研究发现，AMI 病人血浆 miR-21 水平显著升高。与肌酸激酶( CK) 、肌酸激酶同工酶( CK-MB) 和 cTnI 相比，miRNA-21 具有相似的诊断AMI 能力，可能是AMI 诊断的新型生物标志物。本研究以急性胸痛发作6 h 内的急诊病人为研究对象，目的是通过检测胸痛病人循环miRNA-21 表达水平，分析miRNA-21 与冠状动脉病变的关系，进一步阐明miRNA-21 作为AMI 早期诊断标志物的潜在应用价值。本研究结果显示，胸痛发作6 h 内的急诊病人，血浆miRNA-21 表达水平明显高于对照组，且AMI 组循环miRNA-21 表达水平较UAP 组明显升高，AMI 病人miRNA-21 表达水平与血浆cTnT 水平呈正相关。ROC曲线分析显示，血浆miRNA-21 对AMI 具有良好的诊断价值，AUC 为 0.957，95%CI ( 0.908～0.984) 。与 cT-nT 的 AUC［0.877，95%CI ( 0.810 ～0.927) ］比较，miR-21 的诊断价值稍高于cTnT，且miRNA-21 的敏感度和特异性均高于cTnT。两者结合诊断 AMI，AUC 为0.973［95%CI ( 0.952～0.994) ］，敏感度和特异性均明显高于单用miRNA-21 和cTnT。说明联合检测miRNA-21 和cTnT 能早期准确地诊断AMI。与经典的AMI 生物标志物cTnT 结合，miRNA-21 可能是提高诊断敏感性和特异性的潜在新型生物标志物。

已有研究表明，miRNA-21 在多种心血管疾病中起重要作用［16］。管文娟等［17］研究发现，冠心病病人外周血miRNA-21 高表达，AMI 组血浆miRNA-21 表达水平显著高于心绞痛组，且与冠状动脉病变严重程度具有正相关性。Darabi 等［18］研究发现，ACS 病人血清miRNA-21 水平显著高于稳定型冠状动脉疾病病人，miRNA-21 增高可能通过促进炎症反应参与ACS 发病机制。抑制miRNA-21 表达可通过M2 巨噬细胞的抗炎作用减少支架再狭窄［19］。miRNA-21 参与冠状动脉动脉粥样硬化过程，与调控炎性因子、促进炎症反应影响斑块稳定性有关，miRNA-21 增高导致冠心病病人心血管事件发生风险增高。本研究结果显示，随着冠状动脉Gensini 评分增加，AMI 组和UAP 组血浆miRNA-21 和cTnT 水平增加，相关性分析结果显示，胸痛病人血浆miRNA-21 和cTnT 水平与Gensini 评分均呈正相关。由此可见，血浆miRNA-21 和cTnT 水平可作为判断AMI 发生、评估冠状动脉病变程度及预后的重要指标。有研究表明，血浆miRNA-21 水平增高具有抗细胞凋亡、保护心肌等作用。Han 等［20］研究证实，敲除miRNA-21 基因可抑制缺血预处理介导的对局部缺血/再灌注损伤的心脏保护作用，miRNA-21 对缺氧/再氧化诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用。缺血起始miRNA-21 表达增高，miRNA-21 表达增高通过PTEN/PI3K/Akt 信号传导通路起到抑制心肌干细胞凋亡的作用［21］。

由于miRNA 在生物系统中的复杂性，除了患有ACS 病人的不同遗传、社会和治疗特征之外，本研究病人样本量有限，人口之间差异可能影响研究结果，因此需要扩大样本量、纳入不同地区人群进一步验证研究结果。本研究不足之处在于未系统观察miRNA-21 在AMI 发病过程中表达水平变化，这也限制了胸痛症状发作时精确识别miRNA-21 失调能力及对AMI 病人预后的评估价值。今后研究将在AMI 病人住院的不同时间检测miRNA-21 表达水平，并进行出院后随访，评估miRNA-21 表达水平与AMI 预后结局之间关系。

综上所述，AMI 病人miRNA-21 表达水平明显增高，与cTnT 、冠状动脉病变存在一定的相关性，miRNA-21 对早期诊断AMI 具有良好的诊断价值。联合检测 miRNA-21 和 cTnT 可早期准确地诊断 AMI。miRNA-21 可能是提高诊断敏感性和特异性的潜在新型生物标志物。