正交实验法优选香加皮中总黄酮的提取工艺

唐春伟 梁宗义 田志龙 邹婧 王舒玉 王彦予 王俊香

摘      要：通过正交实验法，优选香加皮药材中总黄酮的最佳提取工艺。以香加皮中总黄酮的提取率作为指标，采用超声辅助法对香加皮药材中总黄酮进行提取，以乙醇浓度（A）、超声时间（B）、温度（C）三个提取条件进行单因素实验，在单因素实验的基础上，设计三因素三水平的正交试验。对香加皮中总黄酮提取影响最大的因素是温度，超声辅助法提取香加皮总黄酮的最佳条件为：乙醇浓度90%，温度60 ℃， 超声时间为35 min，药渣重复提取一次。在此工艺条件下香加皮中总黄酮的提取率为2.313%。用超声辅助法进行香加皮总黄酮提取操作简便、提取率高，此数据结果可为香加皮的进一步研究提供理论依据。

关  键  词：香加皮;总黄酮;单因素实验;正交实验;超声辅助法提取

中图分类号：R284.2       文獻标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）06-1166-04

Abstract： The optimal extraction process of total flavonoids from cortex periplocae was preferred by orthogonal experiment. The extraction ratio of total flavonoids from cortex periplocae was considered as index， the flavonoids were extracted by ultrasonic assisted method. Single factor experiment with ethanol concentration（A）， ultrasonic time（B） and temperature（C） as three conditions was carried out. Based on the single factor experiment， the orthogonal experiment of three factors and three levels was designed. The results showed that the most important factor affecting the extraction of total flavonoids from cortex periplocae was the temperature. The optimal conditions for the extraction of total flavonoids from cortex periplocae by ultrasonic assisted method were as follows： the ethanol concentration 90%， the temperature 60 ℃，the ultrasonic time 35 min. The dregs were extracted again. Under above condition， the extraction rate of total flavonoids from cortex periplocae was 2.313%. Ultrasound-assisted extraction of total flavonoids from cortex periplocae is simple and efficient. The results of this data can provide theoretical basis for the further study of cortex periplocae.

Key words： Cortex periplocae; Total flavonoids; Single factor experiment;Orthogonal test; Ultrasonic assisted extraction

香加皮为萝摩科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮。又名狭叶萝藦、羊奶条、臭槐、羊角槐，羊交叶等。春、秋二季采挖，剥取根皮，晒干药用。最早记载于古籍《神农本草经》中，自1977年起《中国药典》均有收载[1]，香加皮具有利尿消肿、祛风湿、止痛抗炎的功效，主治风湿痹痛、水肿、小便不利，对于心悸气短、慢性心力衰竭等也有较好的效果[2]，此外香加皮还具有抗肿瘤的作用[3]，但由于香加皮毒性较大，不易多用、久用。香加皮中的强心苷、江柳毒苷、多糖等成分被较为广泛的研究，但对于香加皮中总黄酮成分的研究则较少。

黄酮类物质广泛存在于自然界中，生理、药理活性强，不良反应较少[4]，是已证实具有抗炎、抗氧化、止咳、平喘与抗癌等多种生物功能活性的多元酚物质[5-7]，其中香加皮中的抗炎作用来源于黄酮类化合物。

本实验在于用正交实验法优选香加皮中总黄酮的最佳提取工艺，为中药香加皮总黄酮化合物的研究提供数据支持。

1  实验部分

1.1  实验仪器

UV9100B紫外可见分光光度计 （北京莱伯泰科仪器有限公司）;FA-1204B电子天平 （上海天美天平仪器有限公司）;XMT数显式电热恒温干燥箱 （上海阳光实验仪器有限公司）;KQ-500GVDV型双频恒温数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）; ST 16R高速冷冻离心机 （赛默飞世尔科技 （中国） 有限公司）。

1.2  试药与试剂

中药香加皮（产地：山西运城 批号：180918 生产企业：亳州市永刚饮片厂有限公司）;芦丁对照品 （国药集团化学试剂有限公司）;无水乙醇为分析纯，氢氧化钠、亚硝酸钠、六水氯化铝试剂也均采用分析纯。

2  实验方法

2.1  芦丁标准曲线绘制

用电子天平精密称取芦丁对照品20.00 mg，将称取的对照品放入干燥的烧杯中，再加入60%乙醇溶液充分溶解，等待充分溶解后转入容量瓶中，定容至100 mL，充分静置后得到浓度为0.20 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别吸取上述浓度芦丁标准溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL置于20 mL具塞试管中，然后补加30 %的乙醇溶液至试管5 mL（上述试管依次加入5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.00 mL），稍后再加入0.30 mL 5%的亚硝酸钠溶液，等待充分混合均匀后放置6 min， 然后加入0.60 mL 10 %的六水氯化铝溶液，等待充分混合均匀后再放置5 min，然后加入2.00 mL 4%的NaOH溶液， 最后加入30 %乙醇溶液定容至试管10 mL，等待充分混合均匀后再放置15 min。15 min过后利用紫外分光光度计在510 nm波长处分别测定上述溶液吸光度[8]。

2.2  供试品试剂的配制

将干燥的中药香加皮粉碎成粗粉，用电子天平精密称取至2.000 g，加入锥形瓶中， 按照固定料液比1：20（g：mL）加入乙醇溶液， 用超声辅助法提取两次，以5 000 r·min-1离心10 min，抽滤，将滤液转移至100 mL容量瓶中， 最后用乙醇溶液定容。

2.3  供试品吸光度的测定

吸取1.0 mL供试品试剂于25 mL具塞试管中，补加4 mL 30%乙醇溶液至试管5 mL，然后加0.30 mL 5%的亚硝酸钠溶液，等待充分混合均匀后放置6 min，然后加0.60 mL 10 %的六水氯化鋁溶液，等待摇匀后放置5 min，然后加2.0 mL 4%的NaOH溶液， 最后加30%的乙醇溶液定容至试管10 mL， 等待充分摇匀后放置15 min。用紫外分光光度计在510 nm波长处测定吸光度。

2.4  香加皮中总黄酮提取率计算

黄酮提取率 = （A×0.697 4+0.002）×100/2 000

式中： A—吸光度值。

2.5  单因素实验

2.5.1  提取温度对香加皮中总黄酮提取率的影响

按照固定料液比1：20、70%乙醇溶液、超声时间25 min的条件下，提取两次，研究提取温度对香加皮中总黄酮化合物得率的影响。提取温度分别为30、40、50、60、70 ℃。

2.5.2  超声时间对香加皮中总黄酮提取率的影响

按照固定料液比1：20、70%乙醇溶液、提取温度60 ℃，提取两次的条件下，研究超声时间对香加皮中总黄酮化合物得率的影响。超声时间考察5、15、25、35、45 min。

2.5.3  乙醇浓度对香加皮中总黄酮提取率的影响

按照固定料液比1：20、提取温度60 ℃、超声时间25 min的条件下，提取两次，研究乙醇浓度对香加皮中总黄酮化合物得率的影响。乙醇浓度考察70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇。

2.6  正交试验优选最佳工艺

在单因素实验基础上，分别按提取温度50、60、70 ℃，提取时间15、25、35 min，乙醇浓度70%、80%、90%这三个因素中的三个水平选择L9 （34）正交表进行正交试验，见表1。采用Spass软件进行方差分析。

3  实验结果与分析

3.1  黄酮标准曲线及曲线方程

将芦丁标准溶液浓度与吸光度分别作为横、纵坐标，得到y =1.470 6x + 0.000 3的回归方程，其中R2=0.999 2，拟合度良好，说明芦丁浓度与吸光度有较好的线性关系，见图1。

3.2  单因素实验结果

3.2.1  温度对香加皮中总黄酮化合物提取率的影响

对超声清洗器温度的考察结果见图2。由图2知，提取温度在30～60 ℃时，随着温度升高香加皮中总黄酮提取率上升，这是由于温度升高能够增强溶剂渗透，分子扩散速度加快， 黄酮的溶出量也会随之增加， 提取温度大于60 ℃时，随着温度升高香加皮中总黄酮提取率下降，这是由于过高温度可能导致黄酮类化合物结构被氧化破坏，部分蛋白凝固不利于黄酮溶出，因此其提取含量降低[9，10]。因此用超声辅助法提取香加皮总黄酮的最佳温度条件为60 ℃，取50、60、70 ℃进行三水平正交试验。

由图3可知，提取时间在5～25 min时，随超声时间增长，香加皮中总黄酮提取率升高，当超声时间超过25 min时，黄铜溶出量下降，这说明超声间过长反而影响黄酮溶出量。因此提取香加皮中总黄酮最佳超声时间为25 min。取超声时间15、25、35 min进行三水平正交试验。

3.2.3  乙醇浓度对香加皮中总黄酮的影响

对乙醇浓度的考察结果见图4。

由图4可知，乙醇浓度在60%～90%时，随醇浓度升高，香加皮中总黄酮提取率升高，这可能是由于乙醇浓度较低，有效成分黄酮没能够充分溶出，随醇浓度的不断升高，香加皮中总黄酮化合物的提取率增加，这是因为黄酮类化合物中含有亲脂性基团，苯环与甲基等，随着乙醇浓度提高黄酮类化合物更有利于溶出。当醇浓度高于90%时，黄酮类化合物提取率下降，乙醇浓度过高会导致溶剂的极性相应下降， 进而一些黄酮苷化合物的溶解度下降， 干扰黄酮的提取，另外由于香加皮中含有其它醇溶性杂质，随醇浓度升高，杂质溶出增多，黄酮类化合物溶出量下降[11-13]。由此可以看出利用超声辅助法提取香加皮中总黄酮乙醇浓度最佳条件为90%。取乙醇浓度70%、80%、90%进行三水平正交试验。

3.3  正交试验结果

通过三因素水平表设计L9 （34） 正交试验来优选超声辅助法提取香加皮中总黄酮的最佳工艺，实验结果见表2。

表3方差分析可以看出， B的P值为0.036，C的P值为0.000，两者P值均比0.05小，在范围之内，说明B和C因素为本实验主要影响因素，而A因素的P值为0.071大于0.05，说明A因素对实验结果影响较小。即温度与超声时间是超声辅助法提取香加皮中总黄酮的主要影响因素，乙醇浓度对超声辅助法提取香加皮中总黄酮影响较弱。超声辅助法提取香加皮中总黄酮的最优组合为A1（A2）B3C2，也就是最佳工艺条件为醇浓度70%（或80%）、超声时间35 min、温度60 ℃。

3.4  最优工艺条件的验证

用电子天平精密称取中药香加皮粉末2.000 g三份，在最佳工艺条件下（醇浓度80%、提取时间35 min、温度60 ℃）进行提取，按“1.3.3”下的方法进行吸光度的测定，并根据“1.3.4”下的方法进行香加皮中总黄酮提取率的计算，结果见表4。

4  讨 论

本实验通过单因素实验、正交实验以及最优工艺条件的验证，最终得出超声辅助法提取香加皮中总黄酮化合物的最佳工艺条件为温度60 ℃、醇浓度80%、超声时间35 min，也得出最佳工艺条件下香加皮中总黄酮化合物的提取率为2.313%。由于传统工艺提取黄酮不仅繁琐复杂，并且有提取率低的缺陷，高效的超声辅助法使用越来越广泛[14]。超声辅助法提取香加皮中总黄酮具有操作简便，提取时间短，无污染，成本较低等优点[15]，重复性与精密度良好更加说明实验方法稳定可行。

黄酮类化合物 （flavonoids compounds），是一类广泛存在于自然界中，由植物光合作用产生的具有2-苯基色原酮 （flavone） 结构的物质，因其药用价值很高，具有广泛的药理活性，因而对黄酮类化合物的研究较为广泛，目前为止，被鉴定出来的黄酮类化合物已经有8 000多种[16]。中药香加皮中含有较多天然药用成分，如多种甙类物质和一些醇类物质等，药用价值较高。目前已有多种主要药效成分来自于香加皮的中药新药上市，对于中药香加皮的研究与开发十分火热[17]，可对中药香加皮总黄酮化合物的抗炎以及抗肿瘤作用做药理活性研究，其临床应用价值与新药开发前景光明。本实验中香加皮总黄酮提取率为2.313%，产率较高，可为香加皮中总黄酮的进一步考察研究做铺垫，在工业生产中也有较好的应用前景。

参考文献：

[1]李瑞雪，吴飞，张继全，等.一测多评法用于香加皮药材质量标准的研究[J].安徽医药，2017，21（07）：1199-1203.

[2]张翼飞，刘志凯，林雨晟，等.香加皮精多糖的单糖组成、热重和热裂解分析[J/OL].食品工业科技：1-11[2019-01-25].

[3]单保恩. 中药香加皮抗肿瘤作用的研究[A]. 中国抗癌协会、中华医学会肿瘤学分会.第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C].中国抗癌协会、中华医学会肿瘤学分会：中国抗癌协会，2006：1.

[4]曹广超，王舒玉，王彦多，等.正交试验法优选发酵蜣螂粉中总黄酮的提取工艺[J].华西药学杂志，2018，33（03）：305-308.

[5]路晓庆，杨芮，李炘正，等.黄酮类物质的生物功能及作用机制研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2018，16（22）：3283-3286.

[6]麦合苏木·艾克木，努尔江·肉孜，阿不都热依木·玉苏甫.维药神香草总黄酮抗炎、止咳、祛痰及平喘作用研究[J].新疆医科大学学报，2014，37（04）：403-406.

[7]李瑶佳，王君，毛攀，等.黄花石莲总黄酮超声辅助提取及抗氧化活性研究[J].食品工程，2018（04）：37-42+48.

[8]吴保承，杨春霞，张栋，等.玉米须黄酮的超声波提取工艺研究[J].化学与生物工程，2011，28（07）：67-69.

[9]陈红惠，李霖娜，聂秋月.广南底圩茶黄酮提取工艺研究[J].文山学院学报，2018，31（06）：23-26.

[10]王彦多，刘春雨，吕世洁，等.正交实验法优化发酵蜈蚣粉中总黄酮提取工艺[J].食品工业科技，2017，38（07）：183-186+192.

[11]李玲，陶亮，何香，等.明月草中黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].食品与发酵科技，2018，54（06）：61-65+86.

[12]马晓，陈刚，张洁.牡丹果皮黄酮工艺优化及抗氧化性研究[J].解放军药学学报，2018，34（06）：506-509.

[13]鱼清雅，郭从嘉，毕进，等.正交试验法优选海南黎药冰糖草茎叶中总黄酮成分的提取工艺[J].陕西中医，2019，40（01）：131-134.

[14]张国涛.超声波法提取荞麦粉中黄酮类化合物的工艺研究[J].当代化工，2017，46（08）：1524-1526.

[15]许建本，苏秀芳，莫耀芳.超声波辅助法提取假苹婆树叶总黄酮及其清除羟自由基能力[J].食品工业科技，2018，39（23）：199-202+209.

[16]陈燕媚，黄锁义.黄皮叶总黄酮的提取及鉴别[J].中国野生植物资源，2018，37（06）：16-18.

[17]李瑞雪，張继全，吴飞，等.香加皮有效成分提取工艺和检测方法的研究进展[J].中国医药导报，2016，13（404）：43-47.