神州草SOD提取工艺研究

王 莹 ，杨海朝 ，薛 刚 ，刘凤霞 ，张 俊 ，王巧玲，王诗萌，陈 玉

（1.南阳理工学院，河南南阳 473004；2.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳 473004；3.河南顺天生物科技有限公司，河南南阳 473300）

SOD最开始的提取原料来源是动物血，但是该方法逐渐被淘汰了，一方面由于成本太高，另一方面因为近年国内外多种流行病的肆虐，很多国家为了避免人与动物病毒交叉感染，都已禁止从国外进口动物SOD[1]。现在SOD提取来源主要是从微生物、微生物发酵和植物中获得，酵母菌、细菌、真菌、生物工程菌等微生物和植物的根茎、叶子、种子或其他瓜果都是提取SOD主要来源[2]。从植物中提取SOD是目前SOD提取研究的热门，大多研究[3-9]是从大蒜、玉米、番茄、桑叶、沙棘、仙人掌等植物中提取SOD。主要利用SOD的物理化学特性，已建立的天然原料粗分离的方法有热变性法、等电点法、氯仿-乙醇沉淀、丙酮分级沉淀法和硫酸铅盐析法等。神州草是一种产量高、生长能力顽强、适应各种极端自然环境的天然绿色草本植物，其组成成分丰富，具有较高含量的SOD和蛋白质等物质[10]。试验以新鲜神州草为原料提取SOD，为企业综合开发神州草资源及生产高活性SOD产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器

神州草，南阳市乾景中药材开发有限公司提供。

三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氯化钠、浓盐酸、L-抗坏血酸（VC）、焦性没食子酸、乙二胺四乙酸二钠、无水乙醇、丙酮等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供。

752N型紫外可见分光光度计，上海精科实业有限公司产品；TGL-16C型高速离心机、TGL-16gR型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产品；BSA224SCW型电子天平，Sartorius（中国） 有限公司产品；FD-1C-80型真空冷冻干燥机，北京奥博康实验仪器有限公司产品；HFM-0530型中空纤维膜小试设备，厦门福美科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 SOD酶活性的测定

选用邻苯三酚自氧化法测定神州草SOD酶的活性[11]。

邻苯三酚自氧化速率测定和酶抑制氧化速率测定加样见表1。

表1 邻苯三酚自氧化速率测定和酶抑制氧化速率测定加样/mL

在测定邻苯三酚的自氧化速率是必须把它的自氧化速率控制在0.07 A/min。

试管中加入4.5 mL pH值8.6浓度50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中恒温保存，20 min后迅速加入50 mmol/L邻苯三酚溶液10 μL，迅速混匀后倒入石英比色杯中，于波长325 nm处测吸光度（对照管用pH值8.6，浓度50 mmol/L Tris-HCl缓冲液代替）。自加入邻苯三酚开始计时，每隔30 s读取1次吸光度，准确记录前3 min吸光度的变化，求出邻苯三酚自氧化速率的平均值记为A0。测定SOD活性时，加入10 μL一定浓度的SOD酶液于25℃保温20 min后，再加入10 μL邻苯三酚，同上操作，算出加入SOD后邻苯三酚自氧化速率的平均值记为A1。SOD产品酶活计算公式如下：

式中：A0——邻苯三酚的自氧化吸光度；

A1——加入SOD后邻苯三酚的自氧化吸光度。

1.2.2 神州草SOD的提取工艺

（1）神州草上清液的制备。①打浆。准确称取新鲜神州草1 kg，加入2.5 L预冷的pH值7.8浸提液，加入质量分数0.25%聚乙二醇溶液250 mL和质量分数3%Triton 80溶液125 mL分别作为保护剂和溶膜剂，搅拌均匀后用打浆机进行打浆。②浸提。将打浆后的神州草浆液放入冰箱浸提1 h。③固液分离。利用纱布过滤除去较大的固形物神州草渣，经低速大容量离心机离心得到神州草清液。

（2）SOD浓缩液的制备。①一次膜处理。用截留相对分子质量为100 000以上的中空纤维膜膜组件超滤，待神州草的浸提液浓缩至200 mL左右时停止，上清液备用。浓缩液为神州草多糖和大分子量蛋白浓缩液（可作为提取多糖使用）。②二次膜处理。一次过膜透过液再通过截留相对分子质量为10 000的中空纤维膜过滤至浓缩液200 mL左右时停止，此时的浓缩液为神州草SOD浓缩液，储存备用。

（3）脱色和激活。准确量取40 mL SOD浓缩液于100 mL的三角瓶，加入0.5 g的活性炭和0.5 g活性白土，再加入质量分数20%氯化铜激活剂0.1 mL，置于120 r/min摇床脱色30 min。以转速7 000 r/min离心，弃去沉淀，所得上清液预冷备用。

（4）有机溶剂去杂。预冷上清液加入上清液总体积30%的氯仿∶乙醇=3∶5混合溶剂，混匀静置5 min，以转速7 000 r/min冷冻离心6 min，吸取上相清液预冷备用。

（5）丙酮沉淀。预冷后的上清液中加入等体积预冷丙酮，混匀静置2 h，以转速7 000 r/min冷冻离心6 min，上清液用于回收丙酮。

（6）真空冷冻干燥。沉淀经真空冷冻干燥即为SOD产品，测定产品SOD酶活。

1.2.3 神州草SOD的提取条件优化设计

（1）浸提液种类的确定。按4种缓冲液进行原料预处理：pH值7.8的0.9%氯化钠、浓度50 mmol/L磷酸盐、Tris-HCl和Tris-HAc浸提液预处理后，得到相应的SOD浓缩液。

（2）激活剂用量的确定。将40 mL浓缩液置于100 mL三角瓶中，分别加入100，125，150，175，200 μL质量分数20%氯化铜激活剂，其他步骤同1.2.2。测定产品SOD酶活，确定最佳激活剂用量。

（3）脱色时间的确定。将40 mL浓缩液置于100 mL三角瓶中，加入最佳激活剂，再加入0.5 g的活性炭和0.5 g活性白土，选择10，15，20，25，30 min。其他步骤同1.2.2。测定产品SOD酶活，确定最佳脱色时间。

（4）乙醇-氯仿混合体系添加量的确定。40 mL浓缩液于100 mL三角瓶中，添加最适激活剂量，按最佳脱色时间处理，加入上清液总体积30%，40%，50%，60%，70%的氯仿∶乙醇=3∶5混合溶剂，离心得上清液。其他步骤同1.2.2。测定产品SOD酶活，确定最佳乙醇-氯仿混合体系添加量。

（5）丙酮用量的确定。最终的上清液分别加0.6，0.8，1.0，1.2，1.4倍体积预冷丙酮后提取SOD。测定产品SOD酶活，确定丙酮最佳用量。

2 结果与分析

2.1 浸提液的确定

采用pH值7.8的4种浸提液，提取神州草中的SOD产品后，测定其酶活。

不同提取液对SOD酶活性的影响见表2。

表2 不同提取液对SOD酶活性的影响（酶活性U/mg·pro）

对表2数据进行方差分析可知，它们之间的差异达到了极显著水平（F=17.695**，见表7）。氯化钠提取液与Tris-HCl提取液差异不显著（显著性检验表略），且氯化钠浸提液比Tris-HCl提取液更经济节约，由于SOD在中性和弱碱性条件下稳定。因此，不同植物浸提液的pH值不一样，对于神州草选择pH值7.8的质量分数0.9%氯化钠溶液为最佳提取液。

2.2 激活剂用量的确定

在SOD浓缩液中加入激活剂20%氯化铜100，125，150，175，200 μL进行酶的提取，最后经过测定得到酶的活性。

激活剂用量对SOD活性的影响见表3。

对表3数据进行方差分析知，它们之间的差异达到了极显著水平（F=294.964**，见表7）。激活剂用量为125 μL与150 μL差异不显著（显著性检验表略），激活剂用量过大时酶活力降低。说明微量金属离子有激活作用，量大时是抑制作用。因此，不同的植物SOD含量不一样，激活剂用量应该是不同的。对于神州草最佳用量是125~150 μL/40 mL酶液。

表3 激活剂用量对SOD活性的影响（SOD 酶活性 U/mg·pro）

2.3 脱色时间的确定

加入浓缩液体积的1.25%的活性炭和1.25%活性白土进行不同的脱色时间处理，测定SOD产品酶活。

不同脱色时间对SOD活性的影响见表4。

表4 不同脱色时间对SOD活性的影响（SOD 酶活性 U/mg·pro）

对表4的数据进行方差分析知：它们之间的差异达到了极显著水平（F=32.131**，见表7）。脱色时间20，25，30 min差异不显著（显著性检验表略），不同的植物所含色素不一样，脱色剂用量和脱色时间也不同。对于神州草加入浓缩液体积1.25%的活性炭和1.25%活性白土进行20 min脱色为最好。

2.4 有机溶剂乙醇-氯仿混合剂添加量的确定

向SOD上清液中分别加入清液总体积30%，40%，50%，60%，70%的乙醇-氯仿的混合溶剂进行去杂，测定SOD产品活性。

氯仿-乙醇混合溶剂添加量对SOD活性的影响见表5。

表5 氯仿-乙醇混合溶剂添加量对SOD活性的影响（SOD 酶活性 U/mg·pro）

上述结果表明，不同的氯仿-乙醇的混合溶剂的添加量对酶产品的活性是差异是极显著水平（F=32.131**，见表7）。40%~50%差异不显著（显著性检验表略），不同的植物杂质种类和量不一样。因此，有机溶剂除杂的量是不同的。对于神州草加入总清液体积的40%~50%氯仿-乙醇（3∶5） 混合溶剂效果最好。

2.5 丙酮加倍量的确定

去杂后的清液中加入不同体积丙酮，测定SOD酶的活性。

不同体积丙酮加倍量对酶活的影响见表6。

表6 不同体积丙酮加倍量对酶活的影响（SOD 酶活性 U/mg·pro）

上述结果表明，不同体积丙酮加倍量的沉淀物SOD活性差异是极显著水平（F=1 584**，见表7），1.0，1.2，1.4加倍量差异不显著（显著性检验表略），0.6加倍量的沉淀物大多为杂质。因此，再次纯化时可以采用先加入0.6倍丙酮，离心除杂，然后再补加到1倍丙酮。对于神州草加入总清液体积的1.0~1.2倍丙酮效果最好。

方差分析见表7。

表7 方差分析

2.6 SOD的纯化

向SOD粗品（约0.6 g）中加入10~15 mL（预冷去离子水的加量视沉淀的多少而定） 的预冷去离子水重溶解，以转速7 000 r/min冷冻离心，上清液预冷后，加入总体积30%的氯仿-乙醇混合溶液除杂，混匀静置5 min，以转速7 000 r/min冷冻离心6 min，吸取上清液，放置冰箱中冷冻备用，下相用于回收氯仿。上清液中加入0.5倍丙酮除杂，然后补加到1.0~1.2倍体积的预冷丙酮，混匀静置2 h，以转速7 000 r/min冷冻离心6 min，所得沉淀冷冻干燥后即为SOD产品。按照优选出的分离提取及纯化工艺重复5次试验，测定产品SOD活性。

不同纯化批次SOD酶活性见表。

表8 不同纯化批次SOD酶活性8/U·（mg·pro）-1

3 结论

由于不同植物浆汁的pH值、SOD含量、色素、杂质种类和含量均不一样，因此浸提液的pH值、激活剂加量、脱色时间及有机溶剂除杂加量也不相同。对于神州草，pH值7.8的0.9%氯化钠溶液为最佳提取液，激活剂最佳用量是125~150 μL/40 mL酶液，加入浓缩液体积的1.25%的活性炭和1.25%活性白土进行20 min脱色，加入总清液体积的40%~50%氯仿-乙醇（3∶5） 混合溶剂，加入总清液体积的1.0~1.2倍丙酮效果最好。综合上述试验结果，最终确定神州草SOD的最佳提取工艺流程。

神州草SOD提取工艺流程图见图1。

图1 神州草SOD提取工艺流程图