内分泌干扰物对水生动物的生殖生理毒性研究进展

吴航利，王 佳，管融资，安 鹏，雷 忻*

(1.延安大学生命科学学院；2.延安市生态恢复重点实验室，陕西延安716000)

随着科学技术的快速发展和人们的物质需求日益增加，一系列的环境问题继而爆发。内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)是一类毒性较高，可与内源激素受体结合或改变内源激素合成、转运、代谢，进而干扰生物内分泌系统的一类外源有机污染物[1，2]。EDCs可通过地表径流等方式进入水生生态系统，在水生生物体内富集，通过食物链的逐级放大效应，使得鱼类等高等水生动物体内富集较高浓度的EDCs，进而影响人类健康[3，4]。EDCs可作为类雌激素或类雄激素在生物体内发挥作用[5]，通过诱导基因异常表达，危害细胞、组织和器官，进而对生物个体甚至种群产生威胁。本文就EDCs对水生动物生殖与生理毒性研究概况进行综述，为进一步认识EDCs的毒害作用，有效控制EDCs污染，改善水域生态环境提供理论依据。

1 常见的EDCs种类

目前，内分泌干扰物可分为三大类：一类是为满足人类生产生活所需要而制造出来，包括有机氯杀虫剂(如，六六六，氯丹，灭蚁灵，滴滴涕等)，工业清洗剂(壬基酚聚氧乙烯醚(Nonylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethano，NPEs)和辛基酚聚氧乙烯醚(Octaphenyl Polyoxyethyiene，OPEs)降解产生的壬基酚(Nonyl Phenol，NP)和辛基酚(Octyl phenol，OP))，以及医药用品(如，己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)和乙炔雌二醇(Ethinylestradiol，EE2))；一类是工业活动而产生的环境污染物，常见的有多环芳烃类(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)，多氯联苯类(Polychlorinated biphenyls，PCBs)，双酚A(BisphenolA，BPA)以及二噁英和相关化合物(如多氯代二苯并二噁英(Polychlorinated dibenzo-p-dioxins，PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(Polychlorinateddibenzofurans，PCDFs))；还有一类是天然的化学物质，包括雌激素(如，雌酮(Estrone，E1)，雌二醇(17-β-estradiol，E2)和雌三醇(Estriol，E3))和雄激素(睾酮(Testosterone，T))。

2 EDCs对生殖系统的影响

有研究证明，内分泌干扰物(如BPA，PCBs，E2，NP，OP等)是水环境常见的雌/类雌激素物质[6-9]。卵黄蛋白原(Vitellogenin，VTG)是环境雌激素类化合物暴露的生物标志物，在孔雀鱼(Poeciliareticulata)实验中，PCBs和E2均能诱导雄性孔雀鱼VTG的产生[8]。研究证实，VTG是卵黄蛋白的前体，为卵细胞运输多种营养物质，与卵生动物的生殖发育密切相关；肝脏VTG的合成主要依赖于雌激素的作用，EDCs与机体内的天然雌激素结构相似，进入动物体内，可干扰VTG正常合成，进而影响生殖系统的正常功能。研究表明雄性或幼体VTG的异常表达与机体的有害病理学改变有关，主要表现为精子生长和精巢发育被抑制以及性成熟改变等[10]。雄性斑马鱼的实验表明，EE2暴露时，斑马鱼精巢壁会变厚，生殖细胞大量丢失；氟他胺(Flutamide，FIU)处理时，精子细胞数量下降；EE2和FIU联合处理时出现协同效应，精巢生殖细胞数量急剧下降[11]。己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)可影响斑马鱼精子发生，使生殖细胞凋亡[12]，这种现象在青鳉(Oryziaslatipes)和银鲫(Carassiusauratus)的研究中也已被证实[13，14]。因此，EDCs会导致水生动物生殖腺和生殖细胞发生异常，从而对动物发育和繁殖产生影响。

3 EDCs对酶系统的影响

3.1 对Ⅰ相混合功能氧化酶系的影响

3.1.1 混合功能氧化酶的作用和分类

内分泌干扰物(如，共平面的芳香性外源有机污染物PAHs、PCBs等)进入脊椎动物体内后与肝细胞内的芳香烃受体(AhR)结合，激活AhR信号通路，Ⅰ相混合功能氧化酶(mixed-functional oxidase，MFO)系统相关酶系产生效应[15]，对机体发挥解毒作用，降低外源性有机化合物的脂溶性，使其形成易排泄的代谢产物[16]。

根据MFO的催化活性，可以将其分为：7-乙氧基异吩恶唑酮脱乙基酶(7-Ethoxyresorufin-O-deethylase，EROD)、7-乙氧基香豆素脱乙基酶(7-Ethoxycoumerin-O-deethylase，ECOD)和芳烃羟化酶(Aryl hydrocarbon hydroxylase，AHH)等，它们是生理生态毒理学中广泛研究的对象[17]。由于对多环芳烃结构和氯代联苯结构的特异性应激反应，EROD被研究者广泛用于检测水生生态系统中此类环境污染物存在的酶学生物标志物。

3.1.2 EDCs对EROD的影响

EROD是细胞色素P-450依赖的MFO系统中的一员[18]，生物体一旦受到胁迫，EROD活性与特定内分泌干扰物存在时间-效应和剂量-效应关系。多齿围沙蚕(Perinereisnuntia)的实验指出，在全氟辛烷磺酰基化合物(perfluorooctane sulfon-Ate，PFOS)的胁迫下，EROD酶活性随时间呈现先上升后下降的趋势，这与食蚊鱼(Gambusiaaffinis)污水暴露实验中，EROD酶活随污染物浓度变化的趋势类似[19，20]。在斑马鱼(Daniorerio)的暴露实验中，阿特拉津毒性胁迫强度与EROD酶活存在先诱导后抑制的关系。这说明外源有机污染物对EROD酶活性的诱导是有限度的，在一定浓度与暴露时间内，EROD酶活被诱导，随着外源有机污染物及其代谢产物在生物体内蓄积，超出机体承受的限度，肝细胞中的酶系统遭受毒性影响而失活；也可能是代谢过程中脂质过氧化物的增强导致细胞色素P-450的构型不稳定而发生变化[20，21]，从而降低EROD酶活力水平。但黑鲷(Sparusmacrocephalus)实验指出暴露在不同浓度苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene，BaP)溶液中，肝脏EROD活性均出现了先升高后降低再升高的变化趋势，这有可能是胁迫初期肝细胞EROD受外源有机污染物的刺激迅速被诱导，随着胁迫浓度升高及其BaP代谢产物的积累，出现了不同程度的脂质过氧化抑制EROD水平，胁迫后期可能是黑鲷自身的免疫防御系统发挥作用使EROD活力水平再升高，这种情况说明胁迫浓度只要不超出黑鲷自身恢复能力的范围，机体可通过自身修复系统恢复至正常水平[22]。

3.2 对Ⅱ相解毒系统抗氧化酶系的影响

3.2.1 抗氧化防御系统发生机制

生物抗氧化防御系统可由两大类组成：1)抗氧化酶:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等；2)非酶抗氧化剂：脂维生素E、维生素C、谷胱甘肽等[23]。抗氧化防御系统产生效应，主要体现在两方面，其一，机体在代谢过程中抗氧化与氧化系统始终处于动态平衡状态，但在环境污染物胁迫下，机体内活性氧自由基暴发，造成氧化损伤，因此，抗氧化防御系统激活，抵御机体产生的氧化应激。SOD是防御系统的第一道防线，能将超氧基阴离子转化为H2O2，但H2O2又会反作用抑制SOD活性；因此，由CAT等组成的第二道防线催化H2O2还原生成H2O等[24]；其二，GST可作为Ⅱ相解毒酶，既能催化还原性谷胱甘肽(GSH)的巯基(-SH)与外源性有毒物质形成亲电子试剂对机体解毒，又能清除内源具遗传毒性的不饱和醛从而降低污染物毒性[25]。

3.2.2 EDCs对抗氧化防御系统的影响

EDCs对抗氧化系统的影响处于一个动态变化中，在EDCs的胁迫下，抗氧化酶的含量被诱导或被抑制，这与EDCs的浓度和种类及暴露时间的长短等密不可分。由于SOD作为检验水生生物氧化损伤较为灵敏的酶，GST具有解毒酶和抗氧化酶双重功能，因此这两者在机体解毒过程的重要作用引起广泛关注。锦鲫暴露多氟代二苯并对二噁英(PFDDs)实验中，SOD活性在暴露3天时显著抑制，在14天时逐渐恢复并较对照组略有增加[26]，这与梭鱼(Mugilsoiuy)暴露于BaP和芘的实验中肝脏SOD活性先抑制后诱导的效应基本一致[27]，这种效应发生可能是胁迫初期机体受到污染物刺激时迅速反应产生氧化应激，胁迫后期SOD活性较处理组略有诱导，这种现象符合抗氧化酶防御机制中的“自适应阶段”，即抗氧化酶此时发挥维持机体生理生化平衡的作用导致SOD酶活恢复[26]。但PFOS胁迫多齿围沙蚕实验中，SOD活性在胁迫初期快速诱导，胁迫后期被抑制[28]；翡翠贻贝(Pernaviridis)暴露四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBPA)的毒性实验中，GST在暴露初期活性持续增加，暴露后期明显抑制[29]。斑马鱼(Daniorerio)实验中，E2、邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate，DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(Dioctyl Phthalate，DOP)四种环境雌激素导致SOD、GST活性呈现低浓度诱导，高浓度抑制的现象[30]。其他研究也得出了SOD和GST活性在环境因子轻度胁迫下诱导、重度胁迫下抑制的结论[31-33]。说明在污染物暴露初期，SOD和GST在生物体内分别发挥抗氧化和解毒功能，而在暴露后期活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)以及外源有机污染物毒性蓄积过高，导致机体抗氧化防御系统异常，相关的一系列酶活受到抑制。

4 EDCs对DNA的损伤效应

4.1 EDCs对DNA损伤机制

EDCs污染可造成核酸受损，常见的DNA损伤包括生成加合物、链断裂、碱基突变错配及脱碱基位点等[34]。目前认为DNA损伤机制可能有3类：(1)外源有机污染物经体内I相酶系代谢活化所生成的中间活性产物可与机体内的生物大分子(主要为DNA)共价结合形成稳定加合物；(2)机体自发或外源性有机污染物(如PCBs、农药等)经I相和II相酶系代谢诱导产生大量的ROS，一旦ROS产生超过机体消除能力或机体抗氧化防御能力减弱，触发氧化应激反应，引起氧化性DNA损伤[35]；(3)通过调控DNA分子自我修复系统相关因子的蛋白表达量达到抑制DNA分子修复的目的。

4.2 EDCs对DNA的损伤效应

早期有研究表明，PAHs代谢过程中产生的活性氧自由基能攻击DNA，导致DNA单链断裂或形成不稳定的无嘌呤的加合物[36]。PAHs的双环氧类代谢产物易结合于DNA形成稳定加合物[37]。大量研究证实，BaP是间接致癌物，经I相酶代谢激活后产生7，8-二氢二羟基-9，10-环氧化苯并(a)芘(benzo[a]pyrene-trans-7，8-diol-9，10-epo-xide，BPDE)，与鸟嘌呤共价结合形成DNA加合物，从而导致核苷酸的替代、缺失和染色体的重排，引起DNA分子损伤[38]，若DNA自我修复系统不能及时使受损DNA分子迅速恢复正常，细胞很有可能发生癌变。褐昌鮋(sebastiscusmarmoratus)实验表明，不同浓度的BaP与肝脏DNA单链断裂损伤基本呈线性的剂量—效应关系[39]。在TBBPA暴露翡翠贻贝亚慢性毒性实验中，TBBPA与DNA的损伤呈现良好的时间-效应和剂量-效应关系[29]。在鲤鱼(Cyprinuscarpio)实验中，浓度为25 μg/L和47 μg/L的二苯并(a，h)蒽(Dibenzo(a，h)anthracene，DbA)可使鲤鱼的DNA损伤分别增加2.7倍和3.8倍[40]；有研究表明暴露BaP会导致贻贝、比目鱼和幼鲈鱼的DNA损伤和基因毒性增加[41，42]；暴露在BaP和苯并(K)荧蒽中时，随着暴露浓度的增加，鲤鱼DNA损伤随之增强[43，44]。目前大量研究证明，内分泌干扰物会对基因水平产生胁迫，同时这也意味DNA损伤可以作为生物分子标记物来评价污染物胁迫的状况。

5 展望

近年来，一些学者已就EDCs对水生动物生殖生理毒性进行了探讨，并取得了阶段性成果，但是在水生生态系统中，生物多样性复杂，EDCs种类众多，不同的EDCs对生物体的毒性作用可能相互影响，表现出协同、拮抗、相加和独立等不同毒性效应。如何全面了解污染物对生物体的联合毒性作用、探讨不同EDCs毒性之间的干扰机制将是未来研究的重要内容；虽然已有研究表明EDCs可对EROD酶活性产生显著影响，但其具体的调节机制还有待于深入研究；如何从分子水平揭示EDCs对水生动物毒性作用及其调控机制也是需要我们进一步研究的热点问题。