莫西沙星联合阿奇霉素对细菌性肺炎老龄大鼠免疫功能的影响

王春喜 张纳新 高亮 王雪

(天津市第三中心医院呼吸科 天津市肝胆疾病研究所 天津市人工细胞重点实验室 卫生部人工细胞工程技术研究中心，天津 300170)

临床上细菌性肺炎也较为普遍，占成人各类病原体肺炎的80%〔1〕。细菌性肺炎因宿主年龄、伴随疾病、免疫状态，临床表现也有较大差异。细菌性肺炎临床症状多样且无典型性，临床多表现为呼吸困难、体温不升等特点，病情发展较为迅速〔2〕。老年人与幼儿免疫功能较弱，机体抵抗力与防御机制差，更易受到疾病侵袭。2008年世界卫生组织发布全球儿童死亡原因报告，全球约有880万名5岁以下儿童死亡，其中约47.6万例死于肺炎链球菌感染，在常见病因中排首位〔3〕。作为大环内酯类抗菌药物，阿奇霉素在临床上应用广泛〔4〕。近年来，由于临床上滥用抗菌药,导致耐药菌株增加,部分患者应用抗菌药治疗效果不佳。目前虽对肺炎发病机制的研究较多，也有相关参与肺炎发病的生化指标已被应用于肺炎的临床诊断和治疗中〔5,6〕，但肺炎的发病机制尚无定论，国内外关于药物对细菌性肺炎免疫功能的研究仍较少。本研究拟探索莫西沙星联合阿奇霉素对细菌性肺炎老龄大鼠免疫功能的影响。

1 材料和方法

1.1试验材料 48只SPF级Wistar雄性老年大鼠(18月龄)购自中国科学院上海实验动物中心，体重(450±50)g。饲养条件：室温(23±2)℃，相对湿度60%,光照周期12 h光照/12 h黑暗的清洁级动物实验室，实验前给予自由进食、饮水。

1.2主要仪器与试剂 超声雾化器购自江苏鱼跃医疗器械有限公司，全自动血液分析仪(Model XT-2000i)购自日本Sysmex公司，组织切片机(Model RM2315)购自德国Leica公司，免疫组织化学试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司(北京，中国)，LH50A型倒置相差显微镜购自OLYMPUS公司(东京，日本)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自PerkinElmer公司(加州，美国)，单克隆抗体NF-κB p65抗体及二抗均购自Santa Cruz公司(纽约，美国)，莫西沙星片购自拜耳医药保健有限公司(批号BJ13520)，阿奇霉素购自上海现代制药股份有限公司(批号H20000477)。

1.3试验菌株悬浮液的制备 取出菌株冻存管，对肺炎链球菌菌株(上海宝米科生物科技有限公司)进行活化。将活化的肺炎链球菌菌株接种于血琼脂平板，37℃恒温培养箱孵育24 h进行培养。取第3代菌株用无菌生理盐水稀释成含细菌浓度为108CFU/ml浓浓的混悬液备用。

1.4动物模型建立及分组 经鼻吸入法〔7〕构建肺炎模型。试验组动物麻醉后，置一个有2个开口的塑料容器中，将108CFU/ml浓度的菌液置于超声雾化器中，以2 ml/min的雾化速度开启雾化器，雾化器接入塑料容器其中1个入口，从另外一端的出口排出，雾化30 min，连续3 d。操作均在生物安全柜内进行。根据随机数字表法，将48只Wistar老年大鼠分成正常对照组、模型组、莫西沙星组、莫西沙星联合阿奇霉素(联合)组各12只。除正常对照组外，其余各组均经鼻吸入法构建肺炎大鼠。在此基础上，莫西沙星组模拟成人常用剂量400 mg/d，大鼠按体表面积折算给药剂量为42 mg/kg〔8〕稀释至1 ml溶液进行腹腔注射给药，5 s内注入完毕，连续7 d。联合组给予同剂量的莫西沙星溶液及阿奇霉素(10 mg/kg 体重，浓度10 mg/ml)，连续7 d。正常对照组和模型组给予同剂量生理盐水。

1.5标本采集 模型建立1 d后，各组禁食水8 h后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg体重)麻醉固定于手术台上。胸腹部皮肤消毒，剑突下腹正中切口打开腹腔，暴露腹主静脉，采集静脉血，用于生化分析。开胸取肺组织，0.9%无菌生理盐水冲洗血迹后，左肺叶放于装有4%多聚甲醛的瓶中固定，保存于4℃冰箱，用于组织切片病理分析和免疫组化检测。

1.6生化指标检测 利用全自动血液分析仪检测白细胞总数，单位以×109/L表示；中性粒细胞比率，单位以百分比(%)表示。采用ELISA测定血清免疫球蛋白(Ig)A、IgG、血清细胞因子干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-8水平，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用流式细胞仪检测外周血中CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.7肺组织苏木素-伊红(HE)染色 取各组肺组织，均经甲醛溶液和石蜡包埋，制备3 μm厚切片，恒温箱60℃内烤片4 h后进行经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水(无水乙醇，95%、80%、70%、50%乙醇)。将切片放入苏木素染料中染色5～10 min，用蒸馏水洗掉切片肺组织表面的苏木素染料，用1%的盐酸-酒精分色3～5 s，使细胞核染成更清晰的深蓝色，自来水冲洗后，1%伊红染料复染细胞核，常规脱水透明，中性树脂封片。

1.8免疫组化 取各组肺组织，均经甲醛溶液和石蜡包埋，制备3 μm厚切片，恒温箱60℃内烤片4 h，4℃冰箱留存，行免疫组织化学染色。H2O2-甲醇液中15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2 min×3 次，加封闭液孵育10 min。倒掉液体加核细胞因子(NF)-κB p65单克隆抗体(1∶500)，4℃过夜。PBS 洗 2 min×3 次，加抗小鼠生物素化二抗孵育10 min，PBS洗2 min×3次。加辣根过氧化物酶(HRP)标记链亲和素孵育10 min，PBS洗 2 min×3次。二氨基联苯胺(DAB)显色、水洗、复染、脱水、透明、封片。高倍镜下，利用Image-Pro Plus6.0 图像分析系统，分析每张切片10个视野下黄色阳性颗粒的平均光密度值为测量结果。

1.9统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、t检验。

2 结 果

2.1各组肺组织病理学变化 正常对照组无论是肺泡、肺泡囊还是肺泡管结构均清晰完整，肺泡隔菲薄，肺泡大小均匀。肺泡上皮细胞排列紧密，肺泡腔和管腔内部未见有炎性浸润。终末和呼吸性细支气管结构完整清晰，可见完整的环形平滑肌。模型组肺泡、肺泡囊、肺泡管、终末和呼吸性细支气管结构不清，出现肺泡融合、肺泡隔增宽，肺泡腔内有血管扩张充血，甚则出血。肺泡上皮细胞排列素乱，部分可见有细胞脱落。肺间质增生、肺泡腔和管腔内见有大量炎性的浸润。与模型组相比，莫西沙星组和联合组肺组织病理均有大幅度所改善。莫西沙星组肺泡、肺泡管和肺泡囊结构均较清晰，终末和呼吸性细支气管结构清晰可见完整的环形平滑肌。肺间质増生减轻、肺泡腔和管腔内仍见有少量的炎性浸润。肺泡腔内部虽仍有血管充血，肺泡隔较薄、肺泡上皮细胞排列整齐。联合组肺泡、肺泡囊、肺泡管、终末细支气管、呼吸性细支气管的结构均完整清晰。肺泡隔菲薄，虽有少量的炎性浸润，肺泡腔内有少量血管充血，但肺泡上皮细胞排列整齐，肺泡大小均匀。见图1。

2.2各组肺组织病理NF-κB p65免疫组化分析 各组NF-κB p65蛋白水平差异显著(P<0.05)。与正常对照组(16.54±1.07)比较，模型组(26.83±2.35)、莫西沙星组NF-κB p65蛋白水平(19.83±1.95)显著升高(P<0.05)。相对于莫西沙星组，联合组NF-κB p65蛋白水平(17.21±1.68)明显降低(P<0.05)。见图2。

图1 各组肺组织病理组织学改变(HE 染色，×100)

图2 各组肺组织病理NF-κB p65免疫组化(×200)

2.3各组外周血白细胞和中性粒细胞比较 模型组白细胞及中性粒细胞明显较正常对照组显著增多(P<0.01)，而莫西沙星组和联合组较模型组明显降低(P<0.01)。相对于莫西沙星组，联合组白细胞数、中性粒细胞数明显降低(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组外周血白细胞和中性粒细胞比较

与正常对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.01；与莫西沙星组比较:4)P<0.05，5)P<0.01

2.4各组外周血清免疫球蛋白及T淋巴细胞亚群对比 模型组IgA和IgG水平显著高于正常对照组(P<0.01)；单药莫西沙星的应用可显著抑制IgA和IgG的分泌(P<0.01)，但效果较莫西沙星联合阿奇霉素明显差(P<0.01)。与正常对照组比较，模型组明显抑制了CD3+和CD4+的产生和CD4+/CD8+，却促进了CD8+的分泌(均P<0.01)。与模型组比较，药物干预组明显降低了CD8+水平(P<0.01)，促进了CD3+和CD4+水平和CD4+/CD8+(P<0.05,P<0.01)，联合组较莫西沙星组更显著(P<0.05)。见表2。

2.5各组外周血清Th1/Th2免疫因子比较 与正常对照组比较，模型组Th1型细胞因子IFN-γ水平明显降低(P<0.01)，TNF-α和IL-2水平却明显升高(P<0.01)；Th2型细胞因子IL-6明显降低(P<0.01)，IL-4和IL-8水平却明显升高(P<0.01)；与模型组比较，莫西沙星组和联合组IFN-γ、IL-6水平显著升高(P<0.01)，TNF-α、IL-2、IL-4和IL-8水平显著降低(P<0.05，P<0.01)。相对于莫西沙星组，联合组IFN-γ、IL-6升高更加明显(P<0.05)，TNF-α、IL-4和IL-8显著降低(P<0.05)。见表3。

表2 各组外周血清免疫球蛋白及T淋巴细胞亚群比较

与正常对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较：3)P<0.05,4)P<0.01；与莫西沙星组比较：5)P<0.01；下表同

表3 各组外周血清细胞因子比较

3 讨 论

老年人细菌性肺炎是老年人感染性疾病死亡的主要原因〔9〕。研究表明，肺炎的发生与直接侵入、细胞损伤及免疫功能紊乱等机制密切相关〔10,11〕。免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统，具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调、共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能〔12〕。机体处于炎性反应或感染期间，免疫因子会表现出异常高或低水平〔13〕。鉴于老年人免疫防御功能减退、呼吸系统的退行性改变且常合并多种基础疾病，更易受到疾病的侵袭，因此做好老年人的疾病防御工作更为必要。研究表明，相对于其他方法，经鼻吸入法构建细菌性肺炎模型操作较简易、可大批量同时操作，可靠性、适用性、可控性、重复性高，伤口感染、出血等并发症的风险小，更符合真实的感染途径〔14,15〕。

作为喹诺酮类药，目前阿莫西林临床上主要用于治疗成人上呼吸道和下呼吸道感染疾病，如社区获得性肺炎、皮肤和软组织感染等〔16〕。2016年中国成人社区获得性肺炎诊治指南推荐莫西沙星等呼吸喹诺酮类药物作为初始经验性抗感染药物〔17〕。研究表明，莫西沙星能够取得较好的疗效，缩短患者稳定的时间，联合其他药物治疗也能取得较好的疗效〔18,19〕。研究表明，42 mg/kg灌胃给药4～6 w，莫西沙星在肺炎大鼠肺组织的穿透率高，血液及肺组织内的游离药物浓度较高，远超过了最低抑菌浓度和防耐药突变浓度，可以有效清除肺炎链球菌，获得较好疗效〔20〕。作为一种新型大环内酯类抗生素，阿奇霉素抗菌谱广、半衰期较长、抗菌活性强、半衰期长、不良反应较少，在炎症部位的组织和细胞内浓度较高，广泛应用于感染性疾病的治疗〔4〕。研究表明阿奇霉素序贯联合痰热清注射液可改善机体免疫力，降低炎性程度〔21〕。临床上，常常将白细胞、中性粒细胞等作为上呼吸道感染或肺炎的临床诊断指标。降钙素原、C-反应蛋白、白细胞、中性粒细胞计数、中性粒细胞-淋巴细胞比值，均可作为急性上呼吸道感染的炎症标记物，用于鉴别和辅助诊断细菌性感染〔22〕。本结果提示莫西沙星联合阿奇霉素治疗肺炎大鼠效果可能要好于单药莫西沙星。

Ig是一组具有抗体活性的球蛋白，广泛存在于血液、分泌液及部分细胞表面，参与机体免疫防御机制〔23〕。IgA广泛分布于呼吸道和消化道，IgG是血清Ig的主要成分,具有抗细菌、抗病毒、抗毒素作用，是机体黏膜局部抗感染免疫的主要抗体〔24,25〕。而T淋巴细胞亚群的测定是检测机体细胞免疫功能的重要指标，对诊断各种免疫疾病，分析发病机制具有重要意义〔26〕。本文结果提示莫西沙星联合阿奇霉素可明显提高细菌性肺炎老龄大鼠的免疫应答能力。

Th1和Th2平衡在维持细胞因子的动态平衡中起关键作用，其动态变化可反映应疾病的不同状态。研究表明，TNF-α水平增高可进一步增加免疫细胞IL-8的表达，IL-8又可促进白细胞黏附聚集在肺部组织，进而导致肺泡气体交换障碍〔27〕。IL-4 增高促进B淋巴细胞分泌IgE，而IFN-γ却在一定程度抑制IgE合成〔28〕。IL-8可由TNF-α介导免疫细胞分泌产生，也可通过激活NF-κB和钙依赖性途径分泌而来〔29〕。本研究结果表明莫西沙星联合阿奇霉素为炎性介质刺激了大鼠外周血炎症因子的分泌，介导了IFN-γ/IL-4为代表的Th1/TH2免疫平衡。莫西沙星联合阿奇霉素更能有效降低细菌性肺炎全身炎症程度，改善细菌性肺炎大鼠的免疫功能。进一步表明，莫西沙星和联合阿奇霉素组均能有效改善肺组织病理损伤，莫西沙星联合阿奇霉素效果较单药莫西沙星稍好一些。NF-κB p65作为NF-κB信号通路蛋白重要的因子，与多种细胞因子的分泌密切相关，在肺损伤发挥重要作用〔30〕。本研究NF-κB p65免疫组化结果与HE染色结果相一致，莫西沙星联合阿奇霉素作用效果更加明显。

总之，本研究成功构建了细菌性肺炎大鼠模型，为探索细菌性肺炎的发病机制与老年群体的治疗方案提供一定的了技术支持。莫西沙星联合阿奇霉素可有效调节Ig、T淋巴细胞亚群水平、Th1/Th2失衡，降低机体全身炎症程度，改善细菌性肺炎引起的免疫功能紊乱，作用效果较单用莫西沙星更佳。