青蒿素对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及β-catenin蛋白表达的影响

杨加顺，冯宝民，韩鑫龙，3， 蔡 珂，李雨桐，3，唐 玲

(1. 南方医科大学第三附属医院康复医学科，广东 广州 510630；2. 大连大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622；3. 南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；4. 广东省中药制剂重点实验室，广东省中药制剂技术工程实验室，广东 广州 510515)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中国死亡率最高的癌症之一，通常在晚期无法获得治愈性疗法，且对常规的化学治疗具有高度的耐药性[1]。因此，迫切需要更有效的HCC临床治疗方法，特别是对手术无法切除的患者。青蒿素近年来被报道具有强效的抗癌活性[2]，体内和体外研究显示，它是抗肿瘤和免疫调节的有效候选药物[3]。然而，青蒿素发挥特定抗癌活性的机制仍不清楚，这可能限制其在临床的进一步发展。本研究旨在探索青蒿素对肝癌细胞的抑制作用及其抗肝癌的作用机制，以便为肝癌患者的治疗和诊断提供新方法，为青蒿素在临床肝癌治疗中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 人肝癌HepG2细胞株，购于ATCC细胞库。

1.1.2药物与试剂 青蒿素，购于美国Sigma公司，在二甲基亚砜(DMSO)中制备青蒿素的储备溶液，在培养基中处理期间DMSO的最终浓度，保持低于0.01%。DMEM培养基，购于美国Gibco公司；β-actin、β-catenin等抗体，购于美国CST公司；Western blot二抗，购于美国密理博公司；SDS-PAGE预制梯度胶，购于美国Life公司；Hoechst 33342、细胞核蛋白与细胞质蛋白提取试剂盒，购于碧云天公司；CellTiter-Blue®Luminescent Cell Viability Assay，购于美国Promega公司；流式抗体试剂盒，购于美国Pharmingen公司。

1.1.3仪器 AMOAF1000自动细胞计数仪(美国Invitrogen公司)；CYTATION5细胞成像检测(美国Bio-Rad公司)；FUSION-FX5-820多功能成像系统(法国VILBER 公司)流式细胞仪(BD Bioscience)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与实验分组 将HepG2细胞维持在含有10%(V/V)胎牛血清和1%(V/V)青霉素、1%(V/V)链霉素的培养基中进行培养。将细胞在37 ℃，含有5% CO2的湿润环境中培养。细胞系均不超过30代的传代数。在细胞系生长至对数期时，进行实验处理。

1.2.2细胞增殖实验 将3×103个HepG2细胞接种到96孔板培养24 h，加入青蒿素(0、50、100、150、200 μmol·L-1)继续培养24、48、72 h。每孔加入20 μL CellTiter-Blue®Luminescent Cell Viability Assay，培养箱孵育10 min，然后使用细胞成像检测仪测量Luminescent的吸光度。实验重复3次。

1.2.3克隆形成实验 将HepG2细胞接种在12孔板中，每孔2 000个细胞，24 h后加药处理。培养箱中培养7 d以允许细胞生长。用1×PBS洗涤细胞2次，再用4%多聚甲醛固定30 min后，1%结晶紫溶液(V/V)染色30 min。多功能成像系统 (FUSION-FX5-820)捕获图像。为了量化集落形成的速率，将集落形式的染色细胞溶解在10%乙酸中，在540 nm处定量测定吸光度。实验重复3次。

1.2.4Western blot检测细胞质与细胞核蛋白表达 青蒿素(0、100、200 μmol·L-1)作用HepG2细胞24 h，PBS洗1遍后，用细胞刮铲刮下细胞。离心收集细胞沉淀，采用细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒，分别提取细胞质蛋白与细胞核蛋白。使用BCA测定法测定蛋白质浓度。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白后，湿法转膜。用含有5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h，TBST清洗3次，加入一抗封闭过夜(4 ℃)。TBST清洗4次，二抗室温孵育1 h后，TBST清洗4次。放入蛋白成像系统中进行曝光。实验重复3次。

1.2.5免疫荧光实验 100 μmol·L-1青蒿素处理HepG2细胞24 h后，提取于6孔板中的细胞进行爬片,加入1 mL 4%多聚甲醛固定液, 室温固定15 min。弃去固定液, 用PBS洗3遍, 每次5 min, 封闭缓冲液中封闭60 min。加入稀释好的一抗β-catenin，4 ℃过夜，PBS洗3遍, 每次5 min，加入二抗Hoechst避光孵育1～2 h，PBS洗3遍, 每次5 min，5%甘油封片，在共聚焦显微镜下观察。实验重复3次。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡率 青蒿素100 μmol·L-1处理24 h后，收集HepG2细胞，并在4 ℃、1 000×g离心5 min。用冰冷的PBS冲洗沉淀，并用70%乙醇固定2 h。然后将细胞用染色缓冲液(含有20 mg·L-1碘化丙啶，20 mg·L-1AnnexinⅤ)在37 ℃避光染色15 min。通过流式细胞仪分析细胞凋亡率。实验重复3次。

2 结果

2.1 青蒿素对HepG2细胞增殖的抑制作用Fig 1结果显示，随着药物浓度的增大，HepG2细胞的生长受到抑制，且在青蒿素100 μmol·L-1时，随着时间的延长，HepG2细胞生长也受到抑制。这表明青蒿素对肝癌HepG2细胞的增殖具有抑制作用，且呈剂量依赖性、时间依赖性。

Fig 1 Effects of artemisinin on viability

A.Artemisinin inhibits the growth of liver cancer cells at different concentrations and different time；B.Artemisinin( 100 μmol·L-1) inhibits the growth of liver cancer cells at different time.**P<0.01vscontrol

2.2 青蒿素对HepG2细胞集落形成的影响Fig 2的集落形成实验结果显示，当青蒿素浓度依次增大时，与空白对照相比较，细胞克隆依次减少。青蒿素50 μmol·L-1时，细胞克隆数降低到(52.46±1.38)%左右；当青蒿素浓度增大到100 μmol·L-1时，细胞克隆数降到(29.06±1.84)%左右。

Fig 2 Colony forming ability of liver cancer cells inhibited

**P<0.01vscontrol

2.3 青蒿素对HepG2细胞凋亡率的影响Annexin V-FITC/PI双染结果显示(Fig 3)，不同浓度的青蒿素作用24，与空白对照相比，实验组的细胞凋亡率增加，并呈浓度依赖性。经100 μmol·L-1青蒿素处理24 h后，实验组HepG2细胞的凋亡率增加为(5.87±0.37)%，经150 μmol·L-1和200 μmol·L-1青蒿素处理后，其凋亡率增加到(10.57±0.15)%和(18.28±1.31)%，其凋亡率明显升高。

2.4 青蒿素对HepG2细胞内相关蛋白表达变化的影响Fig 4的Western blot 结果表明，在青蒿素加药24 h后，与空白对照相比较，随着青蒿素浓度升高，PARP的表达呈上调趋势，说明青蒿素能诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。如Fig 5所示，青蒿素作用下，HepG2细胞质中的β-catenin蛋白表达上调，且在免疫荧光实验中也看到这一现象。提示青蒿能够使HepG2细胞质中β-catenin蛋白表达上调。

3 讨论

HCC是全球癌症相关死亡的主要原因之一，超过80%的肝癌病例发生在中国和非洲等发展中国家[4]。HCC具有长潜伏期，但发展迅速通常到晚期时才被诊断出来。这些特征加上其高度入侵的可能性，导致患有该疾病的患者不能得到有效的治疗。因患有大肿瘤(直径>5 cm)或多个病灶(>3)的患者通常不适合肝切除术[5]。

Fig 3 Effect of artemisinin on apoptotic rate

**P<0.01vscontrol

青蒿素是一种从植物青蒿(ArtemisiaannuaLinn.)中分离出来的天然产物，被广泛用作抗疟疾药物[6]。近年来，青蒿素及其衍生物也已经显示出具有抗癌作用，其抗癌活性的主要机制是诱导细胞凋亡[7]。青蒿素及其衍生物的抗癌潜力与c-Myc、CDC25A、EGFR、γ-谷氨酰胺合成酶(GLCLR)等不同分子的表达有关[8-9]。青蒿素还调节u-PA、MMP-2、MMP-7和MMP-9的水平，所有这些都与转移相关[10-11]。但青蒿素在肝癌细胞中的应用和作用机制研究尚少，虽然详细的机制仍有待阐明，但其低宿主毒性是开发青蒿素作为抗癌剂的主要动力。

本实验通过观察青蒿素对人肝癌细胞HepG2的细胞毒作用，表明不同浓度的青蒿素对HepG2细胞有不同的抑制作用。随着青蒿素浓度的增大，其对HepG2的抑制作用也随之增强；同一药物浓度，随着青蒿素作用时间的延长，其对HepG2细胞的抑制作用也随之增强。在细胞活性实验结果中，当青蒿素浓度为100 μmol·L-1时，药物作用24 h时能够抑制(25.61±3.51)%的HepG2细胞生长；药物作用48 h时能够抑制(35.80±8.42)%的HepG2细胞生长；药物作用72 h时能够抑制(48.36±4.64)%的HepG2细胞生长。

Fig 4 Effect of artemisinin on expression of PARP protein

**P<0.01vscontrol

细胞克隆实验中，随着药物浓度的增大，其克隆数也逐渐减少，在青蒿素浓度为100 μmol·L-1时，其抑制(70.93±2.26)%左右的HepG2细胞。本实验也证实了青蒿素能够诱导肝癌细胞HepG2凋亡，流式细胞实验中，与对照组相比较，其实验组凋亡率明显增加，且随着药物作用时间的延长而增加。且Western blot实验证实了与空白对照相比，PARP蛋白的表达上调，并产生了明显的剪切体。其结果能客观反映人肝癌细胞体外的药物敏感性，也为后续实验中药物不同剂量梯度的设定奠定实验依据，可作为体外筛选药物浓度的方法。

据报道，β-catenin蛋白通过Wnt信号转导途径起致癌作用[12]。Wnt/β-catenin信号转导在维持上皮细胞表型、细胞与细胞的连接和组织稳态中起重要作用[13]。该途径成员的失调可促使上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生。β-catenin是Wnt/β-catenin信号传导途径的关键效应分子[14]。在正常上皮细胞和非肿瘤环境中，β-catenin位于细胞膜上。一旦EMT发生，β-catenin会从细胞质中转移到细胞核(充当转录激活因子)，促使EMT相关基因表达，进而促使肿瘤细胞的侵袭和转移。因此，β-catenin从细胞质向细胞核的转运，在促进EMT相关基因的表达中起重要作用。本实验中，Western blot和免疫荧光实验结果显示，与空白对照相比较，青蒿素能够上调HepG2细胞质中β-catenin蛋白的表达，而细胞核内的β-catenin无明显变化。因此，我们假设青蒿素能够抑制β-catenin从细胞质向细胞核的转运，抑制EMT的发生，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

Fig 5 Effect of artemisinin on expression of β-catenin protein in HepG2

A.Immunoblot against β-catenin shows the increased cytoplasmic β-catenin protein expression upon artemisinin treatment. GAPDH and Lamin B1 used as loading control; B. Immunofluorescence assay shows the expression of β-catenin upon artemisinin treatment.**P<0.01vscontrol

综上所述，青蒿素能够诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡，也可通过抑制β-catenin从细胞质向细胞核的转运，进而抑制上皮细胞向间充质细胞的转变，从而抑制了肝癌细胞的侵袭和转移。该研究将为青蒿素在临床治疗中提供科学的实验依据。然而, 青蒿素是否可以作为一种有效的辅助手段用于肝癌患者的治疗，还有待更加深入的研究。