基于L-NAME诱导的高血压小鼠血清代谢组学研究

杜梦繁，张光远，王志玮，周婷婷，马 鑫

(江南大学1. 药学院、2. 国家功能食品工程技术研究中心、3. 无锡医学院，江苏 无锡 214122)

高血压是心脑血管的主要危险因素，是导致我国居民死亡的主要原因之一[1-2]。高血压的发生和发展受遗传因素和环境因素的共同影响[3]，而在近年来的研究中，造成高血压的主要因素60%与代谢异常有关,约80%的高血压患者存在各种形式的代谢紊乱[4]。

代谢组学使用定量分析和生物信息学方法，检测生物样本中的代谢物组成和含量变化，推断与疾病的发展和治疗相关的特征性代谢产物[5]。其灵敏度高，可以检测疾病早期小分子代谢物的变化[6]。本研究通过N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME)诱导高血压模型小鼠，使用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)对高血压模型小鼠与对照小鼠的血清标本进行检测，寻找高血压病变的差异代谢产物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 野生型C57BL6/J小鼠，♂，平均体质量约23 g，南京大学模式动物研究所提供，许可证编号：SYXK(苏)2016-0012。

1.1.2试剂与仪器 L-NAME(美国Sigma公司)。小鼠无创血压仪(美国IITC)；液相色谱2777C UPLC system、质谱Xevo G2-XS QTOF(Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1L-NAME高血压模型小鼠的构建 饮用添加L-NAME含量为0.5 g·L-1的无菌水，诱导小鼠血压升高，对照组饮用正常无菌水。每天监测小鼠血压变化，连续监测4周。

1.2.2样本采集 小鼠眼眶取血，室温静置2 h，4 ℃、1 500×g离心20 min，取上清。

1.2.3样本预处理 40 μL样品的EP管中加入甲醇120 μL，封口后震荡1 min，室温静置10 min，置于-20 ℃过夜；次日4 000×g、4 ℃离心30 min，取上清。

1.2.4UPLC-QTOF/MS分析条件 采用超高效液相色谱进行色谱分离，色谱柱柱温为50 ℃，流速为0.4 mL·min-1，其中A流动相为水和0.1%甲酸，B流动相为甲醇和0.1%甲酸。对代谢物进行梯度洗脱。每个样本的上样体积为10 μL。

对从色谱柱上洗脱下来的小分子，利用高分辨串联质谱Xevo G2-XS QTOF分别进行正负离子模式采集。采用MSE模式进行centroid数据采集，一级扫描范围为50～1 200 u，扫描时间为0.2 s，对所有母离子按照20～40 eV的能量进行碎裂，采集所有的碎片信息，扫描时间为0.2 s。

2 结果

2.1 动物模型构建与血压变化尾套法测小鼠血压，高血压模型构建成功，L-NAME组的血压较对照组血压有明显的升高(P<0.01)。见Tab 1。

Tab 1 Effect of L-NAME diet on blood

**P<0.01vscontrol

2.2 主成分分析分析显示，L-NAME组与对照组正离子模式和负离子模式下均存在差异，说明高血压组的血清中组分发生了改变。

Tab 2 Serum metabolism biomarkers in hypertensive model mice and healthy control mice

aTrends of L-NAME group with control group of metabolites.(↑):up-regulated;(↓): down-regulated.

2.3 偏最小二乘判别分析L-NAME组与对照组分析结果显示，正离子模式下，R2=0.9807，Q2=0.6623；负离子模式下，R2=0.971 1，Q2=0.822 5。分析结果显示，该PLSDA模型的解释能力和预测能力较好。

2.4 差异性代谢物筛选筛选差异表达的代谢物满足条件：多变量分析PLS-DA模型前两个主成分的VIP值≥ 1；单变量分析fold change≥1.2或者≤0.833 3；q-value<0.05。得到同时满足3个条件的离子即差异离子。筛选出差异相对明显的10个化合物，见Tab 2。

3 讨论

L-NAME是NO合酶抑制剂，可以抑制内源性NO的产生[7]，造成内皮功能障碍，长期给予L-NAME可导致小鼠高血压。高血压小鼠血清代谢物成分发生改变，与正常小鼠相比，在正负离子模式下分别得到107和272个差异代谢物。发现十九烷酸等10种差异相对明显的代谢物，可能成为高血压发生的潜在生物标志物。值得注意的是，在KEGG数据库中搜索了10种代谢物的可能匹配途径，其主要涉及组氨酸代谢、丁酸代谢、碳代谢、TRP通道的炎症介质调节和蛋白质的消化吸收等。我们将进一步深入研究对应化合物造成高血压的具体机制，为高血压的预防、诊断与治疗提供初步参考数据。