响应面优化白芨水溶性多糖提取工艺的研究

唐 森，梁冰娜，覃逸明， 吴国勇，张 鹏

(1.广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西 来宾 546119;2.广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室，广西 来宾 546119;3.广西科技师范学院 科研管理处，广西 来宾 546119)

白芨Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.]是兰科白芨属的一种多年生草本植物，又名为白根、羊角七、冰球子、白乌儿头、地螺丝、白鸡儿、白鸡娃、连及草等。地下有粗厚的根状茎，如鸡头状，富粘性，含白芨胶质，即白芨甘露聚糖，可供药用，有收敛止血、生肌止痛之效，也可供作糊料，花美丽，也可供观赏。产地主要在我国广西、贵州、云南、四川、陕西南部等，白芨是兰科白芨属的药用植物，对细菌和其他病原菌微生物均有抑菌和杀菌作用[1-3]。白芨中的有效成分主要为中性杂多糖,白芨多糖是由β-( 1→4)-甘露糖、β-( 1→4)-葡萄糖和α-( 1→6)葡萄糖残基组成的中性杂多糖[4-5]。根据文献报道，白芨多糖具有抗肿瘤和增强机体免疫等作用，可作为功能性食品成分及膳食营养补充剂，此外白芨中其他主要化学成分中的物质，具有抗炎症、延缓衰老及促进创伤愈合作用等功效[6]。由此可见，白芨多糖蕴含着丰富的药理活性，多糖提取是国内外学者感兴趣的研究热点之一，本试验采用水作为提取试剂，通过水浴提取法提取白芨水溶性多糖，对液料比、提取温度、提取时间对白芨多糖提取率的影响展开研究，并通过响应面法优化，确定最佳提取工艺，为白芨多糖进一步在各个领域的开发利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白芨购于广西来宾市桂中大药房，经广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室张鹏博士鉴定为白芨，试验所用葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

FW135 中草药粉碎机( 天津市泰斯特仪器有限公司)；FA2004B 型电子分析天平( 上海越平科学仪器有限公司)；HH-S4 型恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；KQ-300DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-D(III)循环水多用真空泵(巩义市科瑞仪器有限责任公司)；C-20玻璃仪器气流烘干器(上海贝仑仪器设备有限公司)；H3-20KR台式高速冷冻离心机(湖南可成仪器设备有限公司)；UV-9600紫外/可见分光光度计(北京北分瑞利分析仪器(集团)公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 白芨原材料前处理

将白芨片平铺于烘盘内，置于70℃的热恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重，利用中草药粉碎机将烘干后的白芨片破碎，并过40目筛网，装入密封袋备用。

1.3.2 白芨水溶性多糖的提取

以蒸馏水作为提取溶剂，准确称取白芨粉末1.0 g置于三角烧瓶中，水浴加热提取，按照试验所需的液料比、提取时间和提取温度进行提取，水浴提取后，放入冷水中迅速冷却至室温，过滤，收集提取液，定容，得到供试品溶液。

1.3.3 标准曲线的绘制

参照张翰韬等[7]的方法并稍作修改，用电子分析天平准确称取无水葡萄糖标准品0.0100 g，加入蒸馏水进行溶解，然后转移至规格100 mL容量瓶中，定容后充分摇匀，即可得到100 μg·mL-1葡萄糖对照品溶液，放置于4℃冰箱储存备用。

用移液枪移取葡萄糖对照品溶液0，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL，分别置于具塞试管中，并分别加入蒸馏水2.0，1.7，1.6，1.5，1.4，1.3，1.2，1.1 mL，再加入1 mL质量分数为6%的苯酚溶液，摇晃均匀后迅速加入5.0 mL的浓硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，摇匀后在室温下放置5 min，然后将具塞试管放置于40℃水浴锅中反应20 min，取出迅速用冷水冷却至室温。另以蒸馏水2.0 mL，同以上操作作空白对照，在最大吸收波长(490 nm)处测定吸光度值。然后以葡萄糖质量浓度为横坐标(X，μg·mL-1)，吸光度值(Y)为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。得回归方程Y=0.0832x-0.1704，R2=0.9994，表明线性关系良好。

1.3.4 白芨多糖提取的测定

参照张翰韬等[7]的方法并稍作修改，移液枪吸取上述所得供试品溶液2 mL于100 mL的容量瓶中，加入适量蒸馏水进行定容，摇晃均匀后精密吸取20 mL稀释液于离心管中，加入4 mL Savage试剂(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)，使供试品稀释液与Savage试剂体积比为5∶1，摇匀，放入离心机中在2000 r·min-1条件下离心20 min，离心后取2 mL上清液转移至干净的具塞试管中，按1.3.4中方法测定吸光度，将吸光度值带入线性回归方程，计算出粗多糖溶液的浓度ρ，再按式计算出样品中多糖提取率：

式中：ρ为粗提物样液葡萄糖质量浓度(μg·mL-1)；D为稀释倍数；m为样品质量(μg)；V为最初样品定容体积即液料比体积，mL。

1.3.5 单因素考察试验

本次实验选取蒸馏水作为提取溶剂，采用水浴加热法提取白芨水溶性多糖，考察提取温度、提取时间、液料比三个因素对白芨水溶性多糖提取率的影响。

1.3.5.1 提取温度对白芨水溶性多糖提取率的影响

称取经前处理后的白芨1.0 g于三角烧瓶中，固定液料比为100∶1 mL·g-1，提取时间为4 h，分别设定提取温度为50，60，70，80，90℃，经水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷却至室温，过滤，按“1.3.4”中的方法测定白芨水溶性多糖提取率，每组进行3次平行试验，计算白芨水溶性多糖提取率，确定最佳提取温度。

1.3.5.2 提取时间对白芨水溶性多糖提取率的影响

称取经前处理后的白芨1.0 g于三角烧瓶中，固定液料比为100∶1 mL·g-1，提取温度为80℃，分别设定提取时间为3，3.5，4，4.5，5 h，经水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷却至室温，过滤，按“1.3.4”中的方法测定白芨水溶性多糖提取率，每组进行3次平行试验，计算白芨水溶性多糖提取率，确定最佳提取时间。

1.3.5.3 液料比对白芨水溶性多糖提取率的影响

称取经前处理后的白芨1.0 g于三角烧瓶中，分别按液料比为70∶1，80∶1，90∶1，100∶1，110∶1 mL·g-1加入蒸馏水，用封口膜封口(防止在水浴加热时，水分挥发，影响试验值)，置于80 ℃的水浴锅中水浴4h，经水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷却至室温，过滤，按“1.3.4”中的方法测定白芨水溶性多糖提取率，每组进行3次平行试验，计算白芨水溶性多糖提取率，确定最佳液料比。

1.3.6 响应面法优化试验

在单因素试验基础上，选取(A)提取温度、(B)提取时间、(C)液料比三个影响因素为自变量，白芨水溶性多糖提取率(Y)为响应值，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理[8-9]进行3因素3水平的二次多项回归组合响应面试验，确定提取白芨水溶性多糖的最佳工艺条件，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面因素水平编码

1.3.7 验证实验

选取响应面试验分析得出的最佳工艺参数作为提取条件，3次重复试验实验结果以均值SD表示，计算多糖提取率，以确定白芨水溶性多糖的最优提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度单因素对白芨多糖提取率的影响

如图1所示，随着提取温度的升高，白芨多糖提取量会逐渐升高，原因是温度的升高加速分子扩散运动速度，有利于多糖的溶解，当提取温度为80℃时，白芨多糖提取率达到最高峰值，4.23%。当提取温度低于80℃时，多糖提取量随提取温度的升高增加缓慢，提取温度达到80℃，多糖提取量会显著增加，提取温度高于80℃后，白芨多糖的提取率随提取温度上升而下降。说明提取温度过高，影响白芨多糖生理活性，继续升高温度只会引起部分多糖降解，继而影响白芨多糖的提取率。因而确定本试验采用的水提法提取白芨多糖最佳提取温度为80℃。

图1 提取温度对白芨水溶性多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

2.1.2 提取时间单因素对白芨多糖提取率的影响

提取时间对白芨水溶性多糖提取率的影响如图2所示，当提取时间由3 h至4 h时，随着提取时间的增加，白芨水溶性多糖提取率明显增加，原因是随着时间的延长，白芨多糖能在水中得到充分溶解，提取量不断上升。提取时间在4 h时，白芨多糖的提取率达到最高值，4.23%。当提取时间长于4 h后，白芨多糖提取量反而下降。综合整体能耗及经济因素考虑，确定本试验的最佳提取时间为4 h。

图2 提取时间对白芨水溶性多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

2.1.3 液料比单因素对白芨多糖提取率的影响

图3 液料比对白芨水溶性多糖提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

液料比对白芨水溶性多糖提取率的影响如图3所示，液料比在70∶1～100∶1 (mL·g-1)区间时，随着提取溶剂体积的增大，白芨水溶性多糖提取率随液料比的增大而急剧上升，液料比为100∶1 (mL·g-1)白芨多糖提取率达到峰值，4.23%。当继续增大液料比时，白芨多糖提取率随液料比的增大而呈缓慢下降趋势。因此确定本试验采用的水提法提取白芨多糖的最佳液料比为100∶1 (mL·g-1)。

2.2 响应面法试验结果

2.2.1 试验设计方案结果及回归方程的建立

根据Box-Behnken试验设计原理，依据单因素试验结果，确定提取温度(A)、提取时间(B)和液料比(C)3个因素，以白芨水溶性多糖提取率(Y)为指标，设计三因素三水平的Box-Behnken试验，中心点设计5个重复，试验设计方案及结果见表2。

表2 BOX-BEHNKEN试验设计及试验结果

应用Design expert8.0.6.1软件对表2试验数据进行回归分析，并因此得出白芨水溶性多糖提取率(Y)对提取温度(A)、提取时间(B)和液料比(C)的二元多项回归方程：Y=4.26+0.0075A+0.084B+0.049C-0.058AB-0.078AC-0.065BC-0.14A2-0.16B2-0.06C2，相关系数R2=0.9290，说明该二次回归方程拟合度较好，结果可靠，回归方程方差分析见表3。

表3 响应面方差分析结果

注：R2=0.9689，R2ADJ=0.9290，注:**差异极显著(P<0.01);*差异显著(P<0.05)

由表3方差分析可知，试验模型的(P=0.0002<0.01)，表明该模型回归有极显著差异；失拟值P=0.1149>0.05，表明差异不显著及建立模型数据成立。R2=0.9689，表明响应值多糖提取率的实际值与预测值之间具有很好的拟合度，可以用来优化和预测白芨多糖最佳提取工艺条件。由二次回归方程系数的显著性检验可知，二次项的B2(F=66.68)对试验结果有极其显著性影响。一次项B、二次项A2及交互项的AC有较显著影响，剩余有显著影响，综合以上因素分析，表明考察因素对白芨多糖的提取率存在交互综合影响作用。比较F值大小可反映出各因素对指标的影响规律，由表3可知，一次项影响白芨多糖提取率的主次因素为：提取时间>液料比>提取温度；二次项影响白芨多糖提取率的主次因素为：提取时间>提取温度>液料比；交互项相互作用的主次顺序为：AC>BC>AB。

2.2.2 等高线图和3D响应面图分析

为直观地考查各因素之间交互作用显著与否，以进一步优化试验工艺，运用 Design-Expert8.0.6 软件对白芨多糖提取率响应值分析作图，得到由响应值A、B、C 因素所构成的三维空间图及其三维空间在二维平面上的等高线图。分析结果见图4-图6。由相关因素的3D响应面图及等高线图结合可看出，提取时间对白芨多糖提取工艺的影响极大，在适宜提取时间下提取率较高，而当提取时间过高时多糖提取率下降明显。AC之间的交互作用最显著，BC次之，AB之间交互作用最不显著。

从图4可知，提取时间与提取温度的等高线近似圆形，表明提取时间与提取温度的交互作用对白芨多糖提取率的影响不显著。当提取时间固定时，白芨多糖提取率随温度的上升呈先增加后降低趋势；提取温度不变，随时间的延长白芨多糖提取率先升高后降低。

图4 多糖提取率随时间和温度变化的响应面与等高线Fig.4 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Time and Temperature

从图5可直观看出，当提取时间固定时，随液料比的增加和提取温度的上升，白芨多糖提取率先增大后减小。从3D响应面图及等高线图结合可看出，等高线图近似为椭圆可以说明提取温度和液料比间的交互作用对多糖提取率有影响，且提取温度变化的曲面比液料比变化的曲面陡，说明提取温度对响应值的影响大于液料比。

图5 多糖提取率随温度和液料比变化的响应面与等高线Fig.5 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Temperature and Solid-liquid Ratio

图6中的三维图形和等高线图说明了当提取温度不变时，多糖提取率随时间的延长和液料比增大呈先增加后降低趋势。等高线图近似为椭圆可以说明提取时间和液料比间的交互作用对多糖提取率有影响，图6的响应面曲面最陡峭，表明响应值对提取时间和液料比两操作条件的改变越敏感，提取时间因素的交互作用对白芨多糖提取率的干扰性较强。

图6 多糖提取率随时间和液料比变化的响应面与等高线Fig.6 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Time and Liquid-to-Material Ratio

2.3 最佳条件的预测以及验证试验

通过回归线性模型计算得最佳的实验提取条件是：提取温度78.78℃，提取时间4.10 h，液料比103.77∶1 mL·g-1。结合实际，修正提取条件为提取温度79℃，提取时间4.10 h，液料比104∶1 mL·g-1进行试验，并且进行3次平行实验，白芨多糖的提取率是(4.27±0.05)%。

3 结论

本试验以水做提取剂，采用水提法提取白芨多糖，使用苯酚-硫酸比色法测定白芨水溶性多糖，考查不同液料比、提取温度、提取时间三因素对白芨多糖提取率的影响，并通过响应面分析优化试验设计方案，得出最佳提取工艺条件。最佳的单因素条件为提取温度80℃，提取时间4.00 h，液料比100∶1 mL·g-1。通过响应面分析优化试验，用Box-Behnken软件进行分析，得出二次多项回归方程：Y=4.26+0.0075A+0.084B+0.049C-0.058AB-0.078AC-0.065BC-0.14A2-0.16B2-0.06C2。最后得出最佳的提取工艺条件是提取温度79 ℃，提取时间4.10 h，液料比104∶1 mL·g-1，白芨多糖的提取率是(4.27±0.05)%。