生物卵膜促进小鼠皮肤创面愈合及病理观察

李瑾 韩月臣 蔡晶

山东大学附属山东省耳鼻喉医院耳外科（济南250022）

中耳胆脂瘤手术过程中经常会涉及开放乳突腔，进行大量骨质的磨除以显露病变，便于彻底切除和避免病变残留复发。进行乳突术腔的对外开放往往也是对于一些病例的有效处理方式，这些术腔的上皮化修复的速度和程度决定了术后干耳的时间。应用不同材料覆盖乳突术腔是促进上皮化修复的有效手段，使用价格便宜且促进皮肤修复创面的替代材料已成为迫切的需要。

生物卵膜，主要指鸡蛋壳的白色内膜，含有多种蛋白质、氨基酸、糖类等，是自然界中一种天然的半透膜，有着许多独特的生物学特性。目前，国内应用生物卵膜作为鼓膜贴补材料，发现可以明显促进鼓膜穿孔愈合[1,2]。本实验以6～8 周的健康雄性C57BL/6小鼠为研究对象，通过制备全层皮肤损伤创面，观察生物卵膜对小鼠皮肤损伤的修复作用，为未来其可以用于人类中耳乳突术腔的创面修复提供动物实验数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性C57BL/6 小鼠100 只（由山东大学实验动物中心提供），6～8周龄，体质量（20±2）g，饲养于山东省耳鼻喉研究所实验动物中心SPF 级屏障环境（温度20～23℃，湿度50%～60%）。1%戊巴比妥钠，北京冬哥科技有限公司；4%多聚甲醛溶液、石蜡，上海振普生物科技有限公司；HH-W600数显恒温水浴箱（金坛市精达仪器制造厂）；HG-101-5电热鼓风干燥箱（南京实验仪器厂）；LEICA-2135型旋转切片机（德国LEICA公司）；显微镜成像系统（日本Olympus公司）。

1.2 造模与分组

将100 只健康雄性C57BL/6 小鼠随机分为2mm 组和3mm 组，各50 只，采用1%戊巴比妥钠按40mg/kg体质量进行腹腔麻醉，备皮、75%乙醇消毒背部，标记，每只小鼠均通过眼科剪造成3 个分散分布的深及筋膜的直径2mm 或3mm、相同大小的背部皮肤缺损创面，在将其随机、平均分为5组，生物卵膜，生物卵膜+蛋清液，莫匹罗星，聚维碘酮，对照组。制备生物卵膜：取新鲜的鸡蛋，将其擦干，敲破蛋壳使用无菌持物钳将鸡蛋的内膜轻轻剥出。生物卵膜组在创面覆盖生物卵膜，于边角细线固定缝合一针，生物卵膜+蛋清液是在此基础上每日涂抹新鲜蛋液于生物卵膜上方，莫匹罗星组不予生物卵膜覆盖且每日早晨涂抹适量莫匹罗星一次，聚维碘酮组不予生物卵膜覆盖且每日早晨涂抹适量聚维碘酮一次，对照组不予生物卵膜覆盖且不涂抹药物，每只小鼠的3个伤口确保有1个为对照，1个为生物卵膜覆盖。连续给药，单笼饲养，自由进食、饮水，每日观察并做记录，对比相同大小皮肤缺损的愈合情况，计算各组平均愈合时间。

1.3 创面愈合时间

每日观察创面愈合情况。创面愈合判断标准：创面痂皮脱落，新上皮生成。记录各组动物创面平均愈合天数。

1.4 组织病理学观察

2mm组的小鼠于造模后12天注射过量麻药处死，将愈合创面连同周边部分正常皮肤一并取下，迅速置于新鲜配制的4%多聚甲醛溶液，按常规石蜡制片方法进行脱水透明、石蜡包埋、切片，切片厚度为5μm，苏木精-伊红染色（HE 染色），显微镜观察并拍照。

1.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件。数据均以表示，各组间用单因素方差分析比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠全层皮肤缺损创伤愈合的形态观察

小鼠全层皮肤切除创伤，肌肉组织完全暴露，由于伤到皮肤中的毛细血管，会少量出血，但很快止住。生物卵膜在创面上的覆盖时间保证在4～5天。术后第6 天，各组肉芽组织明显增多，呈深红色，可见毛细血管及创面收缩，创腔逐渐被肉芽组织填平，创缘新生上皮生长明显，创缘可见瘢痕组织形成。生物卵膜组和聚维碘酮组颜色较对照组皮肤浅，无毛发生长，创面为肉芽组织覆盖，创缘新皮较薄，透明，逐渐缩小呈瘢痕愈合。生物卵膜+蛋清液组和莫匹罗星组创面较红，伴有水肿。对照组创面痂皮覆盖明显。术后第12 天，2mm 组的对照组创面仍处于增殖修复期，新长出的表皮向创面中心爬行，逐渐覆盖创面，其余四组创面上皮化明显、收缩明显，生物卵膜组和聚维碘酮组基本愈合，瘢痕淡化，修复完全，几乎看不到创面痕迹。3mm组除生物卵膜组和聚维碘酮组完全愈合，其余三组尚未愈合。

2.2 小鼠全层皮肤缺损创面愈合时间

2mm 组：对照组的愈合时间为（13.40.52）d，生物卵膜+蛋清液组和莫匹罗星组的愈合时间较对照组略短（P＜0.05），生物卵膜组和聚维碘酮组的愈合时间最短（P＜0.05），分别为（8.30.48）d、（8.50.53）d，这两组愈合时间没有差别（表1，图1A）。3mm 组：对照组的愈合时间最长，为（14.50.71）d，生物卵膜+蛋清液组和莫匹罗星组的愈合时间没有差别，且较对照组略短（P＜0.05），与2mm 组不同的是，生物卵膜组和聚维碘酮组的愈合时间显示出差别，生物卵膜组愈合时间最短（P＜0.05），为（10.60.52）d，聚维碘酮组愈合时间较生物卵膜组略长（P＜0.05），但较其余三组均短（P＜0.05）（表1，图1B）。

图1 小鼠皮肤直径2mm、3mm 的创面愈合时间比较（*与对照组比较，P＜0.05；#与生物卵膜组比较，P＜0.05）Fig. 1 Comparison of wound healing time of mouse skin diameter 2 mm and 3 mm（P＜0.05 by oneway ANOVA compared with the control(*)and the biological egg membrane(#)group）.A 在2mm 组中，四组干预创面愈合时间与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），生物卵膜组和聚维碘酮组创面愈合时间最短但两者之间无差异（P＞0.05）。B在3mm组中，四组干预创面愈合时间与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），生物卵膜组愈合时间最短（P＜0.05），且较聚维碘酮组愈合时间短，差异有统计学意义（P＜0.05）。A In the 2 mm group, there was significant difference in the wound healing time between the four groups and the control group (P＜0.05). The wound healing time was the shortest in the biological egg membrane group and the Iodophor group,but there was no difference between the two groups (P＞0.05). B In the 3 mm group, there was significant difference in the wound healing time between the four groups compared with the control group (P＜0.05). The biological egg membrane group had the shortest healing time (P＜0.05), which was shorter than that of the Iodophor group. The difference was statistically significant(P＜0.05).

2.3 创面组织学观察结果

正常皮肤呈现表皮、真皮及皮下组织分布；组织结构完整，细胞分层清晰，真皮层可见波浪状纤维组织，无卷曲扭结，排列有序，分布均匀，真皮内汗腺、皮脂腺及毛囊大小、形态规则（图2A）。

对照组原损伤区被覆表皮再生，表皮细胞层厚薄不一，上皮细胞大小形态及排列欠规则。真皮层肉芽组织及纤维组织增生，皮肤附属器减少（图2F）。

生物卵膜组原损伤区被覆表皮再生，表皮细胞层较薄，上皮细胞形态及排列尚规则。真皮层肉芽组织及纤维组织增生，汗腺及毛囊等皮肤附属器尽管较正常皮肤组减少，但比其他四组明显多，较接近正常皮肤组织（图2B）。

表1 各组小鼠创面平均愈合时间比较（±s）Table 1 Comparison of average wound healing time in each group of mice(±s)

表1 各组小鼠创面平均愈合时间比较（±s）Table 1 Comparison of average wound healing time in each group of mice(±s)

P＜0.05 by oneway ANOVA compared with the control(*)

Group Biological egg membrane Biological egg membrane+egg white solution Mupirocin Iodophor Control n 10 10 10 10 10 Mean healing time（d）Group 2mm 8.3±0.48*11.5±0.71*11.6±0.52*8.5±0.53*13.4±0.52 Group 3mm 10.6±0.52*12.8±0.63*12.5±0.71*11.8±0.63*14.5±0.71

生物卵膜+蛋清液组原损伤区被覆表皮完全再生，表皮细胞层增厚，排列尚规则，真皮层肉芽组织及纤维组织增生，皮肤附属器减少（图2C）。

莫匹罗星组原损伤区被覆表皮再生，表皮细胞层较薄，上皮细胞大小形态不一，排列欠规则，真皮层肉芽组织及纤维组织增生，皮肤附属器减少（图2D）。

聚维碘酮组原损伤区被覆表皮再生，表皮细胞层较薄伴角化过度，真皮层肉芽组织及纤维组织增生，毛囊减少（图2E）。

图2 术后12天各组创面组织学观察（×100）Fig. 2 Histological observation of wound surface in each group 12 days after operation(×100)A 正常皮肤组织结构完整。B生物卵膜组上皮细胞形态及排列尚规则，皮肤附属器较接近正常。C生物卵膜+蛋清液组表皮细胞层增厚，皮肤附属器减少。D 莫匹罗星组细胞排列欠规则，皮肤附属器减少。E 聚维碘酮组表皮细胞层角化过度，毛囊减少。F 对照组细胞大小形态及排列欠规则，皮肤附属器减少(×100)。A Normal skin tissue structure is intact. The morphology and arrangement of epithelial cells in group B were regular, and the skin appendages were close to normal.In group C,the epidermal cell layer was thickened and the skin appendages were reduced. D In the mupirocin group, the arrangement of cells was less regular and the skin appendages were reduced. Hyperkeratosis of the epidermal cell layer and reduction of hair follicles were observed in the E Iodophor group.In the F control group, the size, morphology and arrangement of the cells were lessregular,and the skin appendages were reduced(magnification×100).

3 讨论

全层缺损创面可以模拟临床上常见的皮肤缺损。探索促进缺损创面愈合的治疗措施，对临床上治疗创伤、溃疡等皮肤缺损有较好的指导意义。创伤愈合是一复杂的生物学过程，深二度创伤所致的皮肤全层缺损创面必须进行自体皮肤移植才能修复，但由于患者供皮区有限，特别是在耳廓、外耳道、中耳乳突术后骨质裸露区域，自体皮肤移植修复创面一直受到限制。因此，使用其他类型的皮肤替代物来促进创面愈合已成为迫切的需要。本研究中，我们建立小鼠皮肤全层缺损创面模型，发现生物卵膜对皮肤缺损愈合有促进作用。

生物卵膜氨基酸含量较高，抗原性弱，是一种接近生理状态的半透膜，是良好的天然生物性敷料。使用它贴敷在伤口能保护创面，预防和控制感染，促进肉芽组织生长，同时又能改善局部渗透压，减少渗出，给创面营造一个低氧、微酸、相对无菌、适度湿润的微环境，而且还提供了有利于细胞生长所需要的多种营养物质，有利于上皮细胞的生长和创面愈合[3]。本研究结果显示，在2mm组即小伤口中，与对照组相比，生物卵膜组和聚维碘酮组创面肉芽组织形成较早，愈合时间最短。生物卵膜+蛋清液组的愈合时间略长，但优于对照组的愈合。蛋清液未体现修复优势可能与蛋清液让伤口潮湿，不利于创面恢复有关。莫匹罗星组的愈合情况与生物卵膜+蛋清液组相类似，莫匹罗星的抗菌效果也未见明显优势，说明抗感染在小鼠皮肤愈合过程中不是最重要的因素。而在3mm 组即略大的伤口中，发现与2mm组明显不同的现象，生物卵膜组和聚维碘酮组的愈合时间显示出差别，生物卵膜组愈合时间最短（P＜0.05），聚维碘酮组愈合时间较生物卵膜组略长（P＜0.05），但较其余三组均短（P＜0.05）。这说明生物卵膜在略大的创面中起到了桥梁、支架作用，利于增生移行的上皮细胞生长。

创伤愈合的修复过程中一般会先发生局部炎症反应，继而形成肉芽组织并不断增生，随后新生组织不断地再生、重建修复。在全层缺损创面中毛囊等附属器成分及基底层都被破坏，仅靠创面周缘细胞迁移和肉芽组织形成来填充创面，则速度进行缓慢，甚至难以愈合。本研究中，生物卵膜组愈合最快，病理见上皮细胞形态及排列尚规则，皮肤附属器较其余四组丰富，接近正常皮肤组织形态，病理与肉眼观察相符合。这充分证明了生物卵膜具备明显促进创面愈合的优点，有望大量应用于皮肤损伤修复。

中耳乳突手术术中遗留的广泛术腔骨质裸露，如果进行开放处理，则需要长时间的周围上皮移行进行骨质的覆盖。在感染状态下，肉芽的形成会延长上皮化所需的时间。生物卵膜的促进创面愈合的特点，使得生物卵膜有可能作为术腔移植覆盖物，覆盖于乳突术腔的骨面，减少骨面裸露形成的肉芽，有助于周围上皮移行，缩短上皮化时程，生物卵膜在皮肤损伤后的修复能力，也提示了生物卵膜未来在中耳乳突术腔应用的潜能和方向。

本研究中，我们未选取耳部区域造模，是因为小鼠耳部区域狭窄，且不易固定生物卵膜，当其头部活动时生物卵膜极易脱落，而背部皮肤平坦，面积较大，固定牢靠，所以我们在背部区域建模。

尽管小鼠皮肤和人的皮肤存在差别，生物卵膜的疗效在临床中需进一步验证，但本实验中生物卵膜可以明显促进创面愈合，且其取材方便、价格便宜，切实为临床皮肤损伤修复提供新的治疗方向。下一步，我们将在临床耳科手术中展开研究，期待能为中耳乳突术腔创面修复提供新的治疗方法。