休耕对连作障碍植烟土壤酶活性及细菌群落结构的影响

左 梅，谭 军，向必坤，施河丽，陈红华，彭五星

湖北省烟草公司恩施州公司，湖北省恩施市市府路65 号 445000

恩施州地处鄂西南山区，是湖北省最大的烟叶产区，烟草种植历史悠久，是当地主要的经济作物之一。由于耕地有限和经济利益的驱动，多数烟区存在连作种植习惯，连作已成为当地的主要种植模式。自20 世纪90 年代以来，长期连作和大量使用化学肥料等原因导致当地植烟土壤逐渐退化，生产力下降、病害加重、烟叶品质降低等问题[1]。大量研究表明，长期连作会造成烟田土壤养分与土壤微生物区系非均衡性变化，土壤细菌多样性与均匀度降低，导致土传病原菌大量繁殖以及土壤酶活性下降，对作物的生长和优质生产极为不利[2-4]。有研究表明，土传性病害发生与土壤细菌多样性及种群结构的变化有直接关系[5-7]，烟草科技工作者利用绿肥还田[8-9]、增施有机肥[10]、轮作[11]等措施来提高连作土壤微生物多样性及土壤酶活性，改善土壤微生态条件，以降低土传性病害。这些研究丰富了植烟土壤连作障碍消减技术措施，对推动植烟土壤可持续利用起到了重要作用。

轮作休耕是实现生态恢复的重要措施之一。同时，全国烟叶目前种植规模减小，烟田面积也大幅减少，使得对烟区不同烟田实行轮替休耕成为可能。而对连作障碍烟田实行有计划轮作休耕，对提高烟区土壤地力，实现植烟土壤可持续利用和烟区健康发展十分必要[12-13]。Zeleke[14]研究发现，休耕能增加土壤中水分和矿物质氮含量；吴芸紫等[15]通过对稻-麦连作和稻-休耕农田植物进行物种多样性的比较，发现休耕能显著提高物种丰富度，促进农田生态系统植物物种生态多样性；徐光辉等[16]提出休耕轮作有利于耕层中水分与温度的保持，为微生物提供了适宜的生存条件，更有利于微生物的生长繁殖；王敬敬等[17]的研究发现免耕土壤中光合细菌的多样性显著高于传统翻耕土壤。但有关休耕对连作障碍植烟土壤酶活性及细菌群落结构的影响研究鲜见报道，为此选取恩施长期连作且青枯病历年频发烟田为研究对象，采取休耕方式来改善土壤微生态条件，旨在为连作障碍植烟土壤修复提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验点位于湖北省恩施州宣恩县椒园镇凉风村，北纬29.97°N，东经109.38°E。海拔820 m，属于亚热带湿润气候，年降雨量为1 400～1 500 mm，年平均气温16.5 ℃。试验田块植烟土壤类型为黄棕壤土，连续种烟25 年。土壤基础养分状况：碱解氮186.49 mg·kg-1、速效钾266.74 mg·kg-1、速效磷34.48 mg·kg-1、有机质17.33 g·kg-1，pH 5.04。

1.2 试验设计

试验共设置3个处理，分别为：T1（连作对照）2015年至2017 年连续3 年种植烤烟；T2 休耕1 年（2015 年土地空闲，2016 至2017 年两年种植烤烟）；T3 休耕两年（2015、2016 年土地空闲，2017 年种植烤烟）。每个处理重复3次，每次重复1个小区，每小区种烟60株，随机排列。烤烟供试品种均为云烟87，试验烟苗均采用漂浮育苗，各小区化肥施用量相同，施用比例N：P2O5：K2O 为1:1.98:3.08，田间管理按当地优质烟叶生产技术规范进行。

1.3 土样的采集与制备

2014 年10 月取基础土样。2017 年烟株收获后，各小区采用5点取样法取垄体深度0～20 cm处土壤，混匀分为两份分别装入保鲜袋、透气棉质袋。保鲜袋中的样品放入低温冷藏箱(-20 ℃)中保存，以提取土壤微生物基因组DNA。棉质袋中的样品，除去粗根和小石块，自然风干，用于测定土壤理化性状指标和土壤酶活性。

1.4 测定项目与方法

1.4.1 发病率与病情指数调查

烟株移栽后60 d，按标准方法[18]调查烟田青枯病发病率和统计病情指数。

1.4.2 土壤化学指标与酶活性测定

参照鲍士旦[19]的方法进行土壤理化性状指标的测定。参照文献[20]进行脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的测定；参照杨兰芳等[21]的方法进行过氧化氢酶活性检测，以每克土壤分解过氧化氢的毫克数表示。

1.4.3 DNA 提取及扩增测序

采用Fast DNA® SPIN Kit for Soil（Qbiogene，Inc.USA）试剂盒提取土壤微生物基因组总DNA。采用引物338F（5' -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）扩 增16S rRNA的V3和V4 区。采用引0817F（5' -TTAG CATGGAATAATRRAATAGGA-3'），1196R（5' -TC TGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）扩 增18S rRNA 的V5-V7 区。PCR 反应体系：土壤微生物DNA 模板（10 ng/μL）2.5μL，Forward 引物和Reverse 引物（1 μmol/L）各5 μL，KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min ；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；25 个循环；最后72°C 延伸5 min。PCR 产物经纯化、质检建立测序文库，再对文库进行文库纯化、质检后，送上海伯豪生物技术有限公司，采用MiSeq sequencer（Illumina）进行测序。

采用USEARCH 方法对各样品的Effective Tags进行聚类，将序列相似性达到97%的序列聚类生成操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）[22]。

1.5 数据处理

采用Mothur 软件将测序序列去重复，与已知数据库GreenGene、Silva 等比对，去除嵌合体序列和线粒体、叶绿体序列。计算其距离，并在97%的相似水平下进行OTU 聚类。

随机选取相似度在97%条件下的OTU，利用Mothur 软件做Rarefaction 分析。利用Mothur 软件计算Chao 指数、Shannon 指数和Simpson 指数3 种常用的多样性指数，测序深度用覆盖率（Coverage）表示。利用Excel 2007 和DPS 7.65 软件进行数据处理和统计分析，采用Duncan 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 休耕措施对青枯病发病率的影响

从图1 可以看出，T1（CK）处理的发病率与发病指数均最高，但处理间差异未达到显著水平。发病率与病情指数随着休耕年限增加而降低，T2（休耕1 年）、T3（休耕两年）发病率比对照T1 分别降低22.62%、32.55%，病情指数分别降低3.10、4.21。这表明休耕措施能在一定程度上降低连作烟田的青枯病发病率和病情指数。

图1 休耕措施对青枯病发病率和病情指数影响Fig.1 Effects of lying fallow on incidence and disease index of bacterial wilt

2.2 休耕措施对土壤化学性状指标的影响

从表1 可以看出，与对照T1（CK）相比，T2、T3处理的植烟土壤pH、碱解氮、有机质含量均有不同程度增加，特别是T3 处理有机质与CK 之间差异达到极显著水平；土壤速效磷和速效钾含量则有不同程度下降，但差异不显著。这说明休耕可以提高土壤肥力水平，缓解酸化现象，以休耕2 年的处理效果较好。

表1 各处理休耕后烟田土壤化学性状指标的比较①Tab.1 Soil chemical indexes of different treatments after lying fallow

2.3 休耕措施对土壤酶活指标的影响

过氧化氢酶能催化分解土壤中累积的过氧化物，与土壤有机质含量密切相关，蔗糖酶活性强弱反映土壤肥力水平，对增加土壤中营养物质有重要作用。脲酶与磷酸酶则分别参与土壤中氮、磷的转化与吸收[23]。从表2 可以看出，随着休耕年限的增加，蔗糖酶、过氧化氢酶表现出增加的趋势，T2（休耕一年）、T3 处理（休耕两年）比对照土壤蔗糖酶活性分别增加14.16%、147.85%，过氧化氢酶活性分别增加17.97%、64.13%，休耕两年处理蔗糖酶和过氧化氢酶活性极显著高于对照。但脲酶和磷酸酶活性在不同处理间差异不显著。这说明休耕措施对土壤蔗糖酶和过氧化氢酶活性影响较大。

2.4 休耕措施对土壤细菌群落多样性的影响

Chao 指数可以反映群落物种丰富度，其值越高表明群落物种的丰富度越高，Shannon指数和Simpson指数可以反映群落物种多样性。其中Shannon 指数值越大，群落多样性越高，而Simpson 指数值越小，群落多样性越高[10]。从表3 可以看出，T2、T3 处理的Chao 指数、Shannon 指数均高于对照T1，Simpson指数则均低于对照，但差异未达到显著水平。随着休耕年限的增加Chao 指数呈增加趋势，Simpson 指数呈降低趋势，但仅休耕2 年处理的Shannon 指数与连作间差异达到极显著水平。这说明休耕措施有利于增加土壤细菌群落的丰富度，但这种影响在休耕两年才表现出明显效果。

表2 休耕对土壤酶活性的影响Tab.2 Effects of lying fallow on soil enzyme activities

表3 休耕对土壤细菌多样性的影响Tab.3 Effects of lying fallow on soil bacterial diversity

2.5 不同处理对土壤细菌群落结构的影响

土壤细菌群落结构门水平上分析结果（图2）显示，绿弯菌门(Chloroflexi)，放线菌门(Actinobacteria)，变形菌门(Proteobacteria)，酸杆菌门(Acidobacteria)4个门类在3 个处理样本中的丰度均超过80%。酸杆菌门(Acidobacteria)在休耕处理T2、T3 样本中丰度高于连作处理T1，绿弯菌门(Chloroflexi)在T1、T2 样本中的相对丰度较大，而T3 中具有最大相对丰度的为放线菌门(Actinobacteria)。从属水平上的分析结果（图3）发现，玫瑰弯菌属(Roseiflexus)在T2 和T3 处理中相对丰度较大，以T3 处理表现尤为明显，而在T1处理中相对丰度较低。玫瑰弯菌作为一种光合细菌具有较强的代谢能力和物质转化能力，可以在缺氧环境下利用光能进行光合作用；鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在3个处理间均具有较高的相对丰度，尤其是在T1 处理中。硝化细菌(Nitrolancea)在3 个处理间均具有较低的相对丰度，但在T1处理中相对丰度最高；Gaiella 在3个处理中的相对丰度均较高，尤其是T2处理。青枯雷尔氏菌(Ralstonia)在T1处理中的相对丰度最高，分别是T2、T3 处理的2.0和3.7倍。

图2 不同处理土壤高丰度细菌群落在门水平上的组成Fig.2 Phylum composition of bacterial community with high abundance in soils under different treatments

图3 不同处理土壤高丰度细菌群落在属水平上的组成Fig.3 Genus composition of bacterial community with high abundance in soils under different treatments

3 讨论

连作烟田休耕能有效提高土壤中碱解氮与有机质含量，起到提高土壤肥力的作用，这与Catherine M.Hepp 等[24]进行的短期休耕对土壤肥力的影响研究结果一致。休耕措施对植烟土壤酶活性影响较大，经休耕两年后的烟田土壤中蔗糖酶、过氧化氢酶极显著高于连作烟田土壤。原因可能是休耕与保护性耕作相似，与连作相比对土壤耕作层扰动较轻，而大量杂草等植株根系分布于土壤表层，根系分泌物较多，从而导致土壤酶活性增加[16-17]。本研究中土壤有机质与土壤主要酶活性的变化表现一致，这与杨晓娟[25]、杨媛媛[26]等的研究结果基本一致。

细菌作为土壤中重要的微生物，是土壤物质转化的重要参与者，土壤有机质转化所需能量的90%以上来自微生物的分解作用[27]。本研究中发现，休耕能增加土壤中细菌丰富度与多样性指数，维持土壤微生物菌群结构的稳定性，与徐光辉[16]、王敬敬[17]等的研究结果一致。原因可能是休耕避免了耕作对土壤耕作层的频繁翻动而造成的土壤结构破坏，也可能是休耕避免了化肥和农药的使用进而更有利于微生物的生长繁殖，从而增加细菌种群的多样性[15]。从门、属水平对连作、不同休耕年限土壤细菌群落分析表明，各处理土壤细菌门类与属类组成基本相似，不同细菌属在连作土壤与休耕处理土壤中存在显著差异，玫瑰弯菌属(Roseiflexus)在休耕处理土壤中所占比例较大，青枯雷尔氏菌(Ralstonia)在连作土壤中所占比例较大。玫瑰弯菌属(Roseiflexus) 属于绿弯菌门（Chloroflexi），为绿色非硫光合细菌，具有较强的代谢能力和物质转化能力，对作物生长发育非常有益，雷尔氏菌(Ralstonia) 是一种致病菌，与青枯病的发生关系密切[10]。休耕能有效降低连作烟田青枯病发病率，其原因：一方面是休耕增加了土壤微生物的丰富度和多样性，促进有益微生物通过与病原菌竞争营养物质来减缓病原菌的繁殖速度[28]；另一方面是休耕增加了土壤中有益微生物如玫瑰弯菌属(Roseiflexus)的丰度，有益微生物通过产生多种活性物质如抗体等，抑制了病原菌雷尔氏菌属(Ralstonia)等的繁殖，从而达到降低病害发病率的效果。但本试验中仅涉及休耕单一措施对连作障碍植烟土壤酶活性及细菌群落结构的影响，而有关休耕结合绿肥种植、秸秆还田等措施提高土壤酶活性及优化微生物群落结构，以修复改良土壤环境方面仍有待进一步深入研究。

4 结论

湖北省恩施州宣恩县常年连作烟田休耕能明显增加土壤有机质含量和提高土壤pH，起到培肥土壤和缓解土壤酸化的作用。同时能极显著提高蔗糖酶和过氧化氢酶活性，且休耕两年的效果优于休耕一年。休耕还能改善连作烟田土壤的微生态环境，增加土壤Chao 指数、Shannon 指数，降低土壤Simpson指数，在增加细菌群落的丰富度和多样性的同时可改善土壤细菌群落结构，提高有益菌属如玫瑰弯菌属(Roseiflexus)所占的比例，降低病原菌如雷尔氏菌属(Ralstonia) 所占的比例，从而达到降低烟草青枯病发病率的效果。