β-榄香烯联合卡铂对结肠癌SW480细胞放疗增敏作用的实验研究

文兰香，覃世运，陈丽君，田雯，刘旭初，陈钟勇

自20世纪80年代以来，癌症已成为人类健康的主要威胁，癌症的发病率逐年上升。结直肠癌全球每年有超过100万例新病例和50万例死亡[1]。在我国，每年有15万例患者被诊断出结肠癌，并且有5万人死于该疾病，其5年存活率为60%[2]。放射疗法是结肠癌的治疗策略[3-4]。喜树碱、长春碱、紫杉醇等天然抗肿瘤药物通常存在明显的不良反应和耐药性，因此人们越来越重视开发一种不良反应轻的抗肿瘤药物[5]。β-榄香烯是从姜科植物中分离出来的一类天然萜烯类化合物，具有广泛的生物活性，可治疗再生障碍性贫血、抗肿瘤、改善骨髓功能、诱导细胞凋亡、体外抗HSV21病毒等[6-7]。Caspase-6是凋亡信号级联中的关键半胱天冬酶。已经在由多种凋亡信号诱导的细胞凋亡中检测到Caspase-3、Caspase-6，包括死亡受体激活、生长因子剥夺、电离辐射、不同化学治疗剂[8-10]。本研究拟探讨β-榄香烯联合卡铂对结肠癌SW480细胞放疗增敏作用，为结肠癌的治疗提供理论依据,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验细胞、试药试剂：人结肠癌SW480细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。RIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)；改良Eagle's培养基(DMEM)(美国HyClone公司)；胎牛血清(FBS)(美国卡尔斯巴德公司)；β-榄香烯、卡铂(99.9%，美国Sigma公司)；胰蛋白酶、96孔板、二甲基亚砜、膜联蛋白V/碘化丙锭双染色试剂盒、乙二胺四乙酸酯、聚偏二氟乙烯膜、化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；碘化丙啶(PI)(南京生兴生物技术有限公司)；3%琼脂糖凝胶电泳膜、BCA蛋白定量分析试剂盒(BCA Protein Assay Kit)、二级山羊抗兔IgG抗体(美国Thermo Fisher Scientific公司)；多克隆兔抗Caspase-3蛋白、小鼠Caspase-6蛋白[圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司]。(2)仪器设备：ED-98X射线发生器(美国瓦里安技术中国有限公司)；ELx800酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；FACSCalibur96X流式细胞仪(美国BD公司)；AccessQuick RT-PCR系统(美国Promega公司)；GelDoc 2000 System/QuantityOne Software数字凝胶记录系统[伯乐生命医学产品(上海)有限公司)]。

1.2 实验方法 2019年3— 5月于海南省第三人民医院肿瘤中心分子生物实验室进行实验。SW480组：取结肠癌细胞系SW480细胞液(细胞浓度为5×106个/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于CO2培养箱(37℃、5%CO2、20% O2)；放疗组：细胞培养方法同SW480组，使用X线发生器进行X线照射，以4 Gy/min的固定剂量率发射，照射孵育时间为24 h；β-榄香烯及卡铂组：培养方法同SW480组，分别加入β-榄香烯、卡铂，使其最终浓度分别为80.0 μg/ml、100 μg/ml；β-榄香烯联合卡铂+放疗组： 细胞培养方法同SW480组，加入β-榄香烯、卡铂(浓度分别为80.0 μg/ml、100 μg/ml)，使用X线发生器进行X线照射，以4 Gy/min的固定剂量率发射；用于照射细胞的X射线的能量分级为8 Gy，照射孵育时间为24 h。以上各组每孔设6个平行样，培养72 h。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 SW480细胞增殖水平测定：用对数生长期的SW480细胞进行胰蛋白酶消化，并以5×103个/ml细胞密度接种于96孔板中。孵育24 h，添加MTT溶液200 μl，并继续孵育4 h。随后，弃去细胞上清液，并加入二甲基亚砜100 μl。将96孔板在室温下轻轻摇动15 min，并用酶标仪测量570 nm处的吸光度(OD)值。细胞存活率=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)。

1.3.2 SW480细胞克隆形成数目测定：选择处于对数生长期的细胞并通过移液将其悬浮于培养液中，然后接种到10 cm培养皿中，用梯度因子进一步稀释细胞悬浮液。 将约500个细胞加入培养皿中，在37℃下培养2～3周直至出现可见的细胞克隆形成数目。用PBS轻轻洗涤培养皿2次。将细菌用甲醇5 ml固定15 min，用吉姆萨染色10～30 min，然后计数。计数含有至少50个细胞的细胞克隆形成数目。

1.3.3 SW480细胞凋亡测定：使用膜联蛋白V/碘化丙锭双染色检测细胞凋亡。收集每组细胞，消化并重悬于PBS中。根据试剂盒提供方案，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。在流式细胞术图中，左下象限代表细胞碎片，而右下象限分别代表早期和晚期凋亡细胞。 左上象限代表死细胞。根据以下公式计算每组的凋亡率：细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%，进行3次独立测量取平均值。

1.3.4 SW480细胞周期测定：将对数生长期的细胞离心5 min，用PBS洗涤2次，并在70℃下用70%乙醇固定12 h。然后离心并收集细胞，将细胞用RNA酶A 50 μg/ml在PBS 100 μl中室温下消化30 min，然后用碘化丙啶(PI)5 μl染色30 min，通过流式细胞术分析样品。

1.3.5 SW480细胞Caspase-3、Caspase-6基因及蛋白表达测定：使用TRIzol试剂提取总RNA，并进行第1次ToRT反应。 总RNA 1 μg使用AccessQuick RT-PCR系统进行RT-PCR实验。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列如下：Caspase-3，正向5’-AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3’和反向5’-GACTTGGGAGGTATCCACATCC-3’；Caspase-6，正向5’-GAAATCGTGCGTGACATTA-3’和反向5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3’；β-catenin，正向5’-ATTCGATGACCTTGGAA-3’和反向5’-CCTGAGTCGTACTCCCTTCGT-3’。Caspase-3、Caspase-6、β-catenin扩增产物的预期长度分别为132、259、475 bp，在热循环仪上进行PCR；94℃保温2 min，然后在94℃保温45 s，55℃保温45 s，72℃保温45 s，共32个循环，最后在72℃保温5 min。使用3%琼脂糖凝胶电泳对结果进行半定量分析，并以数字凝胶记录系统进行可视化。

用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3组SW480细胞(SW480细胞组、放疗组、β-榄香烯联合卡铂+放疗组)并用裂解缓冲液(NaCl 150 mmol/L， Tris 50 mmol/L，1%脱氧胆酸钠)裂解，加入十二烷基硫酸钠、1% Triton X-100、乙二胺四乙酸酯5 mmol/L在冰上保持20 min，离心10 min。根据试剂盒提供方案，使用BCA蛋白定量分析试剂盒(BCA Protein Assay Kit)测定蛋白质水平。将等份的细胞裂解物试样在10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶上电泳，再电转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉封闭，在Tween 缓冲盐水4℃下保持2 h。将膜与多克隆兔抗Caspase-3蛋白和小鼠Caspase-6蛋白抗体在4℃下过夜，然后用二级山羊抗兔IgG抗体在室温下保持2 h。化学发光试剂盒检测Caspase-3、Caspase-6蛋白的表达水平，β-肌动蛋白作为内部参考。

2 结 果

2.1 各组SW480细胞OD值、存活率比较 与SW480细胞组比较，放疗组、β-榄香烯组、卡铂组、β-榄香烯联合卡铂+放疗组细胞SW480细胞OD值、存活率水平均降低(P<0.05)；与放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，β-榄香烯联合卡铂+放疗组SW480细胞OD值、存活率水平降低(P<0.05)；放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，SW480细胞OD值、存活率水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组SW480细胞OD值、存活率比较

注：与SW480细胞组比较，aP<0.05；与放疗组比较，bP<0.05；与β-榄香烯组比较，cP<0.05；与卡铂组比较，dP<0.05

2.2 各组SW480细胞克隆形成数目比较 与SW480细胞组比较，放疗组、β-榄香烯组、卡铂组、β-榄香烯联合卡铂+放疗组细胞克隆形成数目降低(P<0.05)；与放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，β-榄香烯联合卡铂+放疗组细胞克隆形成数目降低(P<0.05)；放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，SW480细胞克隆形成数目差异无统计学意义(P>0.05)，见表2及图1(封3)。

表2 各组SW480细胞克隆形成数目的比较个)

注：与SW480细胞组比较，aP<0.05；与放疗组比较，bP<0.05；与β-榄香烯组比较，cP<0.05；与卡铂组比较，dP<0.05

2.3 各组SW480细胞凋亡率、G1期比例比较 与SW480细胞组比较，放疗组、β-榄香烯组、卡铂组、β-榄香烯联合卡铂+放疗组凋亡率、G1期比例升高(P<0.05)；与放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，β-榄香烯联合卡铂+放疗组凋亡率、G1期比例升高(P<0.05)；放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，SW480细胞凋亡率、G1期比例差异无统计学意义(P>0.05)，见表3及图2(封3)。

表3 各组SW480细胞凋亡率、G1期比例的
表达比较

组 别复孔数凋亡率G1期SW480细胞组63.10±0.3466.38±0.95放疗组64.65±0.21a68.66±1.08aβ-榄香烯组64.71±0.26a69.05±1.03a卡铂组64.69±0.25a69.01±1.05aβ-榄香烯联合卡铂+放疗组68.22±0.38abcd75.32±0.84abcdF值15.65418.598P值0.0000.000

注：与SW480细胞组比较，aP<0.05；与放疗组比较，bP<0.05；与β-榄香烯组比较，cP<0.05；与卡铂组比较，dP<0.05

2.4 各组SW480细胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA表达水平比较 与SW480细胞组比较，放疗组、β-榄香烯组、卡铂组、β-榄香烯联合卡铂+放疗组Caspase-3、Caspase-6 mRNA表达升高(P<0.05)；与放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，β-榄香烯联合卡铂+放疗组Caspase-3、Caspase-6 mRNA表达升高(P<0.05)；放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，SW480细胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 各组SW480细胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA
表达水平比较

组 别复孔数Caspase-3 mRNACaspase-6 mRNASW480细胞组60.89±0.290.87±0.29放疗组61.91±0.17a2.08±0.17aβ-榄香烯组61.93±0.19a2.11±0.18a卡铂组61.92±0.20a2.03±0.21aβ-榄香烯联合卡铂+放疗组63.59±0.28abcd4.21±0.29abcdF值19.98725.654P值0.0000.000

注：与SW480细胞组比较，aP<0.05；与放疗组比较，bP<0.05；与β-榄香烯组比较，cP<0.05；与卡铂组比较，dP<0.05

2.5 各组SW480细胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平比较 与SW480细胞组比较，放疗组、β-榄香烯组、卡铂组、β-榄香烯联合卡铂+放疗组Caspase-3、Caspase-6蛋白表达升高(P<0.05)；与放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，β-榄香烯联合卡铂+放疗组Caspase-3、Caspase-6蛋白表达升高(P<0.05)；放疗组、β-榄香烯组、卡铂组比较，SW480细胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表5及图3。

表5 各组SW480细胞Caspase-3、Caspase-6
蛋白表达水平比较

组 别复孔数Caspase-3/β-actinCaspase-6/β-actinSW480细胞组61.65±0.540.96±0.54放疗组62.98±0.87a3.54±0.54aβ-榄香烯组63.01±0.98a3.51±0.65a卡铂组63.02±0.94a3.58±0.78aβ-榄香烯联合卡铂+放疗组64.99±0.86abcd5.65±0.49abcdF值32.36526.987P值0.0000.000

注：与SW480细胞组比较，aP<0.05；与放疗组比较，bP<0.05；与β-榄香烯组比较，cP<0.05；与卡铂组比较，dP<0.05

注：A.SW480细胞组；B.放疗组；C.β-榄香烯组；D.卡铂组；E.β-榄香烯联合卡铂+放疗组

图3 各组SW480细胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表达水平比较

3 讨 论

放射治疗是结肠癌的一种重要治疗方式，特别是局部晚期肿瘤，可诱导肿瘤细胞死亡，在不影响病变周围重要器官(例如正常肝组织、小肠和肾)的情况下，难以实现肿瘤自由基辐射剂量。因此，任何在没有剂量递增的情况下增加辐射治疗功效的化合物(即在较低剂量下的较高治疗反应)将对癌症治疗有益。因此，对这种生物反应调节剂的研究是癌症治疗中的主要要求。β-榄香烯对人类癌细胞具有细胞毒活性。研究发现，β-榄香烯通过引起细胞色素P450生物活化诱导MCF7乳腺癌细胞的抗癌活性；β-榄香烯可诱导人肺癌A549细胞G1/S期阻滞和细胞凋亡；β-榄香烯在实验小鼠中具有放射增敏特性，并通过活性氧(ROS)的产生诱导宫颈癌细胞凋亡[11-14]。本结果与上述讨论符合，同时提示β-榄香烯联合卡铂能增加结肠癌SW480细胞放疗敏感性，抑制结肠癌SW480细胞增殖、侵袭水平，促进肠癌SW480细胞凋亡水平。

半胱天冬酶是由15个成员组成的半胱氨酸蛋白酶家族，在程序性细胞死亡和炎性反应中起着重要作用。其中，Caspase-3、Caspase-6是一种典型的凋亡执行者，被启动子Caspase-8或Caspase-9激活后，切割细胞内其他功能关键的蛋白质，导致细胞凋亡。许多抗癌疗法，包括细胞毒性药物、放射疗法或免疫疗法都可以通过激活Caspase-3来导致肿瘤细胞死亡。因此，许多研究人员使用Caspase-3激活作为癌症治疗功效的替代标志物[15-16]。增加的Caspase-3、Caspase-6活性通常被认为是细胞凋亡的标志，并且是癌症治疗疗效的阳性指标。最近，有越来越多的证据表明，Caspase-3、Caspase-6可抑制应激诱导的癌细胞生长、细胞迁移、侵袭和肿瘤血管生成[17]。在人类癌症治疗中，一些研究报道了proCaspase-3、Caspase-6水平较高或活跃的患者预后高于proCaspase-3、Caspase-6水平较低的患者。最近的一项研究表明，Caspase-3、Caspase-6作为肿瘤抑制因子，在细胞暴露于化学物质和辐射后具有抑癌作用。Caspase-3、Caspase-6通过旁分泌信号通路参与抑制肿瘤再生；Caspase-3、Caspase-6通过抑制血管生成微环境来抑制肿瘤生长[18]；此外，高表达Caspase-3、Caspase-6的膀胱癌细胞化疗后其肿瘤抑制效果更佳。本结果提示β-榄香烯联合卡铂能促进SW480细胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA、蛋白表达，增加结肠癌SW480细胞放疗敏感性。

综上所述，β-榄香烯联合卡铂能增加结肠癌SW480细胞放疗敏感性，抑制结肠癌SW480细胞增殖、侵袭水平，促进结肠癌SW480细胞凋亡水平；其机制与β-榄香烯联合卡铂能促进SW480细胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA、蛋白高表达有关。