SiO₂/松香-腰果酚核壳型液相色谱固定相高效分离天麻素

李国祥 邓杰 曾磊 史伯安 雷福厚

摘 要 以腰果酚、松香、球形硅膠为主要原料，制备了SiO2/松香-腰果酚核壳型高效液相色谱柱，可高效分离天麻素。将腰果酚进行酯化改性，封闭酚羟基，然后以腰果酚酯为单体、改性松香为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂，将三者混合并均匀涂敷到硅胶表面，通过自由基聚合反应成功制备了一种核（SiO2）-壳（膜）型液相色谱固定相。采用红外光谱、扫描电镜和透射电镜对固定相进行了表征。采用湿法装柱，并选用苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷和对甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为天麻素的竞争分子，以乙腈-0.05% H3PO4（3∶97，V/V）为流动相，检测波长220 nm，流速0.3 mL/min，初步研究了固定相在室温下对天麻素的分离性能。此固定相的粒径约为5 μm，且粒径分布均一，壳（膜）厚约75 nm，对天麻素具有良好的拆分性能，对2种竞争分子的分离度（Rs）分别为7.43和12.35。本方法简单高效，为天麻素的分离纯化提供了新思路。

关键词 腰果酚; 松香; 核壳型固定相; 天麻素; 液相色谱

1 引 言

天麻素的化学名为4-羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，是中药天麻的有效活性成分之一，具有良好的镇痛、抗惊厥、抗衰老及增强免疫力等功效[1，2]，广泛用于生物医药领域。从植物天麻中分离提取天麻素是获取天麻素的重要方法。目前，分离纯化天麻素的方法主要有柱色谱法[3，4]（包括硅胶层析法和分子印迹柱色谱法）和大孔吸附树脂纯化法[5]。这些方法虽然能较好地分离纯化天麻素，但也存在明显的不足。一方面，糖类、蛋白质等杂质会导致粗提液浓稠粘黏，操作困难，耗时较长，有机溶剂消耗量大，柱层析的效率较低[3，6]; 另一方面，许多大孔吸附树脂主要是由苯乙烯和二乙烯基苯合成，分离纯化过程中可能有毒性原料残留在天麻素中，严重威胁天麻素类药品和保健食品的安全[7～9]。因此，开发低毒、高效地分离纯化天麻素的方法意义重大。

高效液相色谱法（HPLC）因其简单、高效等特点，被广泛应用于天然产物分离纯化[10，11]。该方法的关键是制备选择性好、来源丰富、价格低廉的色谱固定相。传统的液相色谱固定相一般是以球形硅胶为原料，通过涂敷或键合的方式，在硅胶表面引入具有高选择性的物质[12，13]。对分离天然药物而言，涂敷型固定相的性能优于键合型固定相，但涂覆型固定相难以涂敷均匀，且受流动相的影响，具有易溶胀、流失的缺陷[14]。因此，采用既能涂覆均匀、又能防止溶胀流失的方法对于制备涂覆型固定相非常关键。

松香是天然无毒、价格低廉的林产品，主要由树脂酸组成（图1A）。树脂酸是一类分子式为C19H29COOH的同分异构体的总称，主要成分为枞酸（图1B），分子中独特的氢化菲环结构使其具有较好的力学刚性[15]。腰果酚是腰果壳油的主要成分，苯环上连有羟基，间位连有C15长链，具有不饱和烃的性质，有较好的柔韧性[16]。以腰果酚功能单体和松香基交联剂合成的腰果酚-松香基聚合物具有丰富的立体结构，能选择性识别大分子物质，这对色谱分离非常重要[17，18]。本研究组前期工作中，以松香为原料合成出了松香基液相色谱固定相，并成功分离了小檗碱、紫杉醇等生物碱及5种芳香烃[15，19，20]。基于前期的研究结果，本研究将封闭羟基的腰果酚涂敷于球形硅胶表面作为功能单体，以改性松香为交联剂，采用微乳液表面聚合法合成腰果酚-松香基聚合物，在硅胶表面形成一层均匀的膜，得到核（SiO2）-壳（膜）型结构的液相色谱固定相，并用于高效分离天麻素。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪（美国Nicolet公司）; Zeiss Supra 55 Sapphire扫描电镜（德国蔡司公司）; Tecnai-G2-F30 FEI透射电镜（美国FEI公司）; Z0050716型装柱机（美国Scientific Systems公司）; 不锈钢色谱柱（4.6 mm×250 mm，大连伊力特分析仪器有限公司）; LC-15C分析型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

腰果酚（济宁华凯树脂有限公司）; 改性松香交联剂（广西民族大学林产化学与工程重点实验室提供）; 硅胶（苏州纳微科技公司）; 石油醚（沸点60℃～90℃）、3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（阿拉丁试剂公司）; 天麻素对照品（≥95.4%，中国食品药品检定研究院）; 苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（>98%）、4-甲氧基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（>98%）、偶氮二异丁腈（阿拉丁试剂公司）; 乙腈（GR，美国Fisher Scientific公司）。其它试剂均为国产分析纯。

2.2 核壳型固定相的制备和表征

2.2.1 腰果酚酯的制备[21] 称取6 g腰果酚于单口烧瓶中，滴入2.4 g三乙胺，加入55 mL石油醚（沸点60℃～90℃）溶解，加入甲基丙烯酰氯3.3 g，冰水浴下反应1.5 h，然后升温至70℃回流反应4 h，抽滤，收集滤液并洗至中性，旋蒸后真空干燥，得到腰果酚酯。

2.2.2 硅胶烷基化 称取5 g硅胶（5 μm）于单口烧瓶中，加入50 mL 10% HCl溶液，在70℃下油浴回流7 h，反应结束后，将硅胶洗至中性，在80℃下真空干燥12 h。称取活化硅胶于单口烧瓶中，加入甲苯、吡啶及3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷，在80℃下油浴回流反应8 h，整个反应在氮气保护下进行。产物依次用丙酮、甲醇、正己烷洗涤，真空干燥，得到硅烷化硅胶，记为SP0。

2.2.3 核壳型固定相的制备 将腰果酚酯、改性松香交联剂、偶氮二异丁腈配成油相，超声处理3～4 min，使其均匀分散，将油相溶于氯仿中，得到质量体积浓度为5.4%混合溶液。将混合溶液涂覆到硅烷化硅胶上，并置于250 mL单口烧瓶中，称取3 g十二烷基硫酸钠溶于100 g水中，倒入到单口烧瓶中，加装球形冷凝管，85℃反应2 h，95℃反应2.5 h。产物经无水乙醇索氏提洗，过筛，即得到SiO2/松香-腰果酚核壳型固定相，记为SP1。

2.2.4 形貌以及成分表征 将腰果酚和腰果酚酯在65℃进行真空干燥12 h，将干燥后的样品涂抹到KBr晶片上，采用傅里叶变换红外光谱仪在4000～450 cm1范围下扫描; 取少量固定相于样品管中，加入甲醇超声，得到均匀分散的悬浮液，用毛细管取少量滴到导电胶上干燥后固定在铜板上，对微球进行喷铂处理，在2.5 kV条件下用场发射扫描电子显微镜（SEM）以及透射电子显微镜（TEM）进行形貌观察。

2.2.5 装柱 采用湿法装柱，用恒压泵将目标固定相填充于不锈钢色谱空柱（250 mm×4.6 mm），在42 MPa的压力下装柱30 min，在21 MPa的压力下装柱20 min，待柱压平衡后，将色谱柱卸下，装上柱头及筛板，得到SiO2/松香-腰果酚核壳型固定相色谱柱。

2.3 液相色谱实验

分别配制浓度为5×104 mol/L天麻素和苯基β-D-吡喃葡萄糖苷、天麻素和对甲氧基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷的混合样品溶液，用SiO2/松香-腰果酚核壳型固定相色谱柱分离天麻素及其衍生物。检测条件：检测波长220 nm，流动相为乙腈-0.05% H3PO4溶液（3∶97，V/V），柱温25℃，流速0.3 mL/min，进样体积20 μL。分离度（Rs）依据公式Rs= 2（t2-t1）/（W1+W2） 计算，其中，t1、t2分别为相邻两峰中前一峰和后一峰的保留时间; W1、W2分别为此相邻两峰的峰宽。

3 结果与讨论

3.1 SiO2/松香-腰果酚核壳型固定相的制备

腰果酚酯的制备过程原理如图2所示。在碱性条件下，甲基丙烯酰氯分子中的酰氯键断裂，与腰果酚的羟基发生取代反应，形成一个新的酯键。产物的红外光谱如图3所示。在3500～3000 cm1范围内的吸收峰主要是羟基的吸收峰。与腰果酚相比，腰果酚酯在此范围内的吸收峰消失，且在1710 cm1处有CO双键的吸收峰，这是酯基的特征吸收峰，说明已成功合成了腰果酚酯，封闭了腰果酚的羟基。

硅烷化硅胶的红外光谱如圖4所示。3440 cm1处是硅胶表面的羟基吸收峰，942 cm1为SiOH的不对称伸缩振动吸收峰。与硅胶相比，硅烷化硅胶在3440 cm1处羟基的吸收峰明显变小，942 cm1的SiOH的吸收峰完全消失，且在1708 cm1处出现了酯基的CO双键的吸收峰，说明已经成功对硅胶进行了硅烷化改性。

将腰果酚酯涂敷在经3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷改性的球形硅胶表面，在设计条件下，在硅烷化硅胶表面发生原位聚合，形成一层均匀的薄膜。SiO2/松香-腰果酚核壳型固定相的表面形貌如图5所示。由图5A和图5C可知，SP0和SP1固定相均具有良好的球形结构，粒径约5 μm，分布较均一; 与SP0相比，SP1固定相表面较为粗糙，存在明显的附着物; 比较图5B和图5D可知，表面附着的是一层均匀的薄膜，厚度约75 nm。上述结果表明，已成功制备了SiO2/松香-腰果酚核壳型结构的材料。

3.2 对天麻素的分离性能

为了研究SiO2/松香-腰果酚核壳型固定相对天麻素的分离性能，选择与天麻素分子结构非常相似的2种天麻素衍生物苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷和对甲氧基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为竞争分子，其结构如图6所示。

以乙腈-0.05%磷酸（3∶97，V/V）为流动相，流速0.3 mL/min，柱温25℃的条件下考察了SP1固定相对天麻素及其衍生物的分离性能。图7A为天麻素和苯基β-D吡喃葡萄糖苷混合物在SP1色谱柱上的分离谱图，天麻素和苯基β-D吡喃葡萄糖苷在SP1色谱柱上完全实现了基线分离，分离度Rs=7.43，表明SP1色谱柱对天麻素和苯基β-D吡喃葡萄糖苷具有较好的拆分性能。图7B为天麻素和对甲氧基苯基β-D吡喃葡萄糖苷混合物的色谱图，天麻素和对甲氧基苯基β-D吡喃葡萄糖苷在SP1色谱柱上也可以实现完全基线分离，分离度Rs=12.35，同样表明了SP1色谱柱对天麻素和对甲氧基苯基β-D吡喃葡萄糖苷也具有较好的拆分能力。天麻素和2种竞争分子的分离度均大于6。较高的分离度表明，在本实验的色谱条件下，SiO2/松香-腰果酚核壳型液相色谱固定相能高效分离天麻素及其衍生物，为天麻素的分离纯化提供了一种新的方法和思路。

4 结 论

以腰果酚和松香2种可再生资源为原料，在改性球形硅胶表面通过原位聚合，成功制备了一种SiO2/松香-腰果酚酯核壳型液相色谱固定相。此固定相对天麻素具有较好的分离选择性，能完全基线分离天麻素及其竞争分子。此固定相制备方法简单易行，原料丰富易得，对实现天麻素的高效分离纯化提供了新的途径，有较好的应用前景。

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