血清药理学在抗肿瘤中草药研究中的应用

刘翠翠

（沧州医学高等专科学校，河北 沧州 061000）

血清药理学实验方法于20世纪80年代由日本学者田带真一提出，Iwama H进行了完善，它是指给动物灌服实验所用药物（尤其是中药或其复方制剂等成分复杂药物）一定时间后，采集动物血液，离心得到含原型药物或其代谢产物的血清（含药血清），此方法模拟了体内药物的作用环境，是一种半体内的体外实验方法。该方法的特点是以中草药有效成分为切入点，同时结合了药物代谢动力学观点，即无论单味中草药还是其复方（方剂）化学成分有多复杂，在经适当途径给药后，经过吸收、分布、代谢等体内过程，最终入血的成分才能够真正发挥药理效应。从某种意义上来说，中草药及其方剂的血清药理学和血清靶成分的研究既秉承了中医中药治疗疾病的精华又借鉴了许多相关学科的现代研究成果[1]。本文就血清药理学在抗肿瘤中草药研究中的应用做一综述。

1 中草药有效成分的研究

中草药有效成分（有效部位）的研究主要采取药物与细胞直接接触的体外实验方法，观察细胞直接接触药物后的生长状态，从而客观地通过药物作用的有效浓度（IC50）判断药物的活性，还可以在细胞水平甚至分子水平研究药物的作用机制[2-3]。例如近几年来研究颇多的中药半枝莲的有效成分半枝莲总黄酮[4]、半枝莲黄芩苷[5]、半枝莲多糖[6-7]、半枝莲二萜[8]的抗癌试验及作用机制研究均为体外细胞实验。

对中草药的有效成分进行血清药理学方面的实验研究，可以使实验条件更加接近细胞和药物作用的真实环境，必要时还可以做血药浓度-时间曲线分析。例如，体内药理实验研究证实川芎有效成分川芎嗪可以抑制小鼠Liwes肺癌细胞的增殖，降低其肿瘤细胞侵袭转移的发生，同时可以降低肿瘤组织中的血管密度。进一步的血清药理学实验证实，含有川芎嗪的药物血清能够对抗血管内皮生长因子（VEGF）诱导的人脐静脉内皮细胞ECV304细胞的增殖，为川芎嗪抗肿瘤血管生成做出了解释[9]。在另一项川芎嗪的血清药理学实验研究中[10]，川芎嗪含药血清可以抑制人肝癌HepG2肿瘤细胞的增殖，同时结合RP-HPLC测定血清药物浓度证实，川芎嗪腹腔注射143.0 ng/kg，1次/天，连续7天，最后一次给药后0.5小时采集血液，血清药物浓度为385.1 μg/ml，对肿瘤细胞生长抑制率为46.10%。

2 单味中草药的研究

单味中草药粗提物的抗肿瘤作用体外初步筛选工作，采用血清药理学实验方法可以避免药物制剂粗糙对细胞学实验干扰过大的缺点，就有效成分而言研究的目的更加明确。

例如天然药物白花蛇舌草，具有清热、解毒、消痛、散结、抑瘤等功效，临床上经常配伍其他中草药用于治疗肝癌、食管癌、乳腺癌等。陈晨等[11]的一项实验研究，同时观察了白花蛇舌草注射液在体内和体外的抗肿瘤活性。体内试验：给予荷瘤小鼠（人肝癌HepG2细胞）白花蛇舌草注射液，观察肿瘤发生率；体外试验：小鼠灌胃白花蛇舌草，获取含药血清，而后观察药物血清对人肝癌细胞HepG2的影响。结果：体内试验空白对照组、白花蛇舌草组、5-氟尿嘧啶组小鼠肝癌的发生率分别为100%、60%、30%，与对照组相比，差异有统计学意义，且白花蛇舌草组小鼠肿瘤的体积为（1 873±47）mm3，与对照组（3 042±56）mm3相比，差异具有统计学意义。体外试验10%、15%、20%中药白花蛇舌草含药血清组抑制率分别为（14.20±1.42）%，（24.60±3.76）%，（35.35±4.81）%，其中以 20%的浓度抑瘤率最高，依据上述试验结果和其他实验资料，研究人员已经初步确定了白花蛇舌草抗肿瘤作用的有效部位。

水蛭亦是临床上经常用来配伍抗肿瘤方剂的动物药，李小菊等[12]在对水蛭抑制肿瘤血管生成的实验研究中发现，SD大鼠每天灌胃水蛭悬浊液1.25 ml/100 g，连续给药7 d，最后一次给药后2 h采集血液，以终浓度为0.5%、15%、25%、35%、45%的水蛭含药血清与EA.hy926血管内皮细胞株共培养，证实水蛭含药血清能抑制EA.hy926细胞的增殖，且具有时间和剂量依赖性，同时证实水蛭含药血清抑制肿瘤组织血管增生可能与降低 HIF-1 α、mRNA、VEGF mRNA的表达和 HIF-1 α 蛋白表达水平有关。苦参也是经常配伍于抗肿瘤方剂的中药，张宏梅等[13]通过血清药理学方法观察了中药苦参煎剂对SPC-A1人肺癌细胞的抑制作用。首先SD大鼠灌胃苦参煎剂150 ml/kg，2次/天，3天后腹主动脉采血，获取药物血清，以不同浓度的含药血清作用于SPC-A1细胞，MTT法观察药物对肿瘤细胞生长的抑制作用，流式细胞仪观察细胞的周期分布。结果证实，不同浓度的含药血清对SPC-A1细胞的生长均具有抑制作用，血清浓度为20%时，抑制率可达62.29%，且含药血清细胞组细胞大多停滞于G0/G1期。另外，欧冰凝等[14]对中药八角莲的血清药理学研究发现，30%八角莲的含药血清可抑制人肝癌SMMC-7221细胞增殖，抑制率可达31.27%，与对照组相比，具有统计学意义。

3 中药方剂（复方）的研究

抗肿瘤中药方剂（复方）的突出特点是多组分活性、多靶点协同作用，其研究一直是中药现代化研究的重、难点之一。近年来，抗肿瘤中草药方剂（复方）的药理学研究，尤其是基础性研究采用血清药理学方法的越来越多。中药抗肿瘤方剂（复方）的血清药理学研究主要包括方剂抗肿瘤活性的筛选，作用机制的探讨，处方的研究（处方解析），等等。

3.1 方剂抗肿瘤作用的初步筛选

方剂（复方）抗肿瘤活性体外细胞实验初步筛选的评价指标主要是肿瘤细胞增殖的抑制率和肿瘤细胞的凋亡率。例如，消癌解毒方是国医大师周仲瑛教授根据多年临床实践经验总结形成的治疗肿瘤的中药复方制剂[15]，家兔灌胃给予消癌解毒方而后采集含药血清使其与人结肠癌HT-29和HCT-116细胞共同培养，培养的含药血清浓度为15%时，以肿瘤细胞生长抑制率为评价指标，结果消癌解毒方含药血清对两种肿瘤细胞的抑制率分别为42.7%和50.2%，确证了该方剂的抗肿瘤活性。在陈晓琦等[16]对扶正消瘤颗粒的血清药理学的研究中亦以肿瘤细胞生长抑制率作为评价指标，证实扶正消瘤颗粒的含药血清对人肝癌HepG2细胞具有抑制其生长的作用，且抑制作用同浓度高低和时间长短具有平行关系。在另外一项中药方剂鳖甲煎丸化裁方[17]的血清药理学的研究中以肿瘤细胞凋亡率作为评价指标，结果发现SD大鼠灌胃鳖甲煎丸化裁方水煎剂，以10%、20%浓度含药血清与人肝癌 HCCLM3细胞共培养，24 h、48 h的凋亡率分别为7.90%、12.22%和11.95%、13.89%，相对对照组的细胞凋亡率5.29%和5.73%，有统计学意义（P＜0.05），且实验结果呈现出明确的量效关系。

3.2 抗癌作用机制探讨

在明确方剂（复方）具有抗肿瘤活性之后可以进一步探讨其抗肿瘤作用的机制，中药方剂（复方）抗肿瘤作用机制的探讨主要集中于对肿瘤细胞周期的影响以及对相关肿瘤基因等的影响。

关于方剂（复方）抗癌对细胞周期的影响研究较多采用的方法是流式细胞术。例如对中药方剂参芪抑瘤方的血清药理学研究首先证实该方剂含药血清对BGC-823胃癌细胞的生长有抑制作用，进一步流式细胞术研究证实这一作用的机制在于将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期[18]。类似的研究表明中药方剂补肾抑瘤汤的含药血清诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡的作用机制在于将PC-3细胞的增殖阻滞于G2/M期[19]，而中药方剂生脉注射液的含药血清能使人胃癌耐药细胞GC7901/VCR周期阻滞于DNA合成前期，从而干扰细胞周期，抑制耐药细胞的增殖[20]。

其他有关方剂（复方）抗肿瘤作用机制的研究还有仇江辉等[21]的方剂扶正透毒祛毒复方对髓系MRD-L患者CD34＋细胞源DC诱导过程中IL-2、sIL-2R的影响，翟林柱等[22]的益气除痰方对弥漫大B细胞淋巴瘤增殖及AKT表达的影响以及楼姣英等[23]的中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞产生免疫相关细胞因子的影响等。扶正透毒祛毒复方含药血清可以促进CD34＋细胞向DC转化的机制可能与促进IL-2的分泌，减少sIL-2R的形成有关。益气除痰方的抑瘤作用可能参与抑制了AKT磷酸化的信号通路，从而对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-ly10细胞的生长具有抑制以及促进其凋亡的作用。清毒栓含药血清可显著诱导细胞内免疫相关细胞因子IL-8、TNF-α基因的表达，使其表达量增加，其作用机制可能是通过促进相关基因的表达量来增加相应细胞因子蛋白的表达。

3.3 处方配伍的研究

以中医理论为依据，结合现代药理学实验手段研究中药处方配伍方式是促进中西医结合以及中医药现代化发展的重要途径之一。例如陈亦晖对健脾养胃方（由黄芪、党参、陈皮、法半夏、白术、白芍、当归、三棱、莪术、白花蛇舌草、石见穿、茯苓、木香、砂仁、炙甘草十五味中草药组成）进行了拆方研究。健脾养胃方是中医治疗脾胃病的代表方，通过健脾益气养胃之法，使气血生化之源不断，有助于胃癌治疗的整个过程，对该方进行配伍研究具有实际意义。研究人员首先将该方拆方为理气化痰方（陈皮、半夏组成）、行气破血方（三棱、莪术、石见穿组成）、行气化湿方（砂仁、木香组成）3个复方，连同健脾养胃方全方制备药物血清进行血清药理学研究。结果发现，这些组方含药血清对BGC-823（人胃癌细胞）和 BGC-823/5-Fu耐药株的抑制率均随着药物浓度的升高越来越强，且与肿瘤细胞是否耐5-氟尿嘧啶（5-Fu）无关；在细胞凋亡实验中发现，各组方含药血清均可诱导细胞凋亡，且与浓度呈正相关，但行气破血方（三棱、莪术、石见穿组）与其余各组相比，凋亡率较低；在随后的体内抑瘤实验中，5-Fu组、健脾养胃全方组、行气化湿方组、健脾养胃全方+5-Fu组、行气化湿方+5-Fu组，抑瘤率分别为19.01%、36.30%、32.35%、55.19%、48.72%，均高于单用 5-Fu组，且健脾养胃全方组抑瘤效果强于行气化湿方组，应用中药各组方组不良反应较单用5-Fu组少且不受细胞耐药的影响。该项研究的结论是从总体治疗效果来说健脾养胃全方组是抑制BGC-823和BGC-823/5-Fu细胞增殖的最佳配伍形式[24]。

3.4 其他

通过血清药理学研究中药方剂（复方）的抗肿瘤作用还包括联合用药，化疗增效减毒以及抗肿瘤转移、侵袭等。例如，隋雨桐等[25]研究发现芪杉方含药血清不仅能够抑制人肺癌细胞A549的增殖，降低 Caspase-9以及 PI3K等蛋白、基因表达量，同时还与临床常用化疗药物顺铂联合使用具有协同作用。史晓光等[26]在对参芪扶正注射液的血清药理学研究中发现，化疗药物5-Fu、顺铂注射液联合含药血清后，相较于单用化疗药物，对于小鼠巨噬细胞RAW264.7的抑制明显降低，证实参芪扶正注射液可以改善化疗药物所造成的免疫抑制。另外叶依依等[27]在对中药方剂乳移平的研究中发现，乳移平含药血清能够逆转TGF-β1诱导的Smad4蛋白及mRNA的高表达，从而抑制TGF-β1诱导的4T1高侵袭能力，为乳移平的抗肿瘤复发转移提供了实验依据。

总之，血清药理学实验工作的开展为中草药特别是中药方剂的研究提供了便利，使得成分复杂的中草药及粗制剂进行细胞实验成为可能，因此在中药抗癌药物的研究中得到广泛使用。尽管血清药理学研究还存在不足，但是作为一种研究手段问世20年来已经成为中草药有效成分研究的主要思路之一。