新疆马铃薯镰刀菌根腐病发生危害调查及病原菌鉴定

杨 波，郭成瑾，王喜刚，沈瑞清,

(1.宁夏大学 农学院，银川 750021；2.宁夏农林科学院植物保护研究所，银川 750002)

马铃薯是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物[1]，粮蔬饲兼用，具有很高的营养、药用和经济价值[2-3]。新疆是中国马铃薯产区之一，因马铃薯性喜冷凉、耐旱、耐贫瘠、高产、适应性强等特点，近年来，新疆马铃薯的种植面积大幅增加[4]。据报道，马铃薯各种病害的发生及危害也逐年加重，其中真菌性病害发生最重[5-7]，镰刀菌引起的根腐病作为真菌性病害中的一种，在马铃薯的生长期及储藏期均有发生，不仅制约马铃薯的产量，而且影响马铃薯储藏期的品质，是限制新疆马铃薯产业发展的重要因素。

镰刀菌(Fusariumssp.)是世界范围内分布的一类真菌，寄主范围广，侵染能力强，可侵染植物的根、茎、穗和果实，引起植物的根腐、茎腐等多种病害[8-9]。本研究中马铃薯镰刀菌根腐病是由镰刀菌引起的马铃薯根、茎及薯块发病的病害总称，其中由镰刀菌引起的马铃薯储藏期病害称为干腐病，镰刀菌干腐病是马铃薯储藏期危害最严重的病害之一[10]，可使储藏期的马铃薯平均减产6%～25%[11]，产量损失最高可达60%[12]。镰刀菌侵染马铃薯块茎，通常表现为薯块颜色发暗、褐变、内部常呈空心[13]，从具有典型发病症状的块茎上分离最多的镰刀菌为茄病镰刀菌(F.solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、黄色镰刀菌(F.culmorum)、接骨木镰刀菌(F.sambucinum)、半裸镰刀菌 (F.semitectum)[14-15]。不同地区引起马铃薯镰刀菌干腐病的种类有一定差异，据报道，在北美和部分欧洲国家，接骨木镰刀菌和蓝色镰刀菌(F.coeruleum)被认为是引起马铃薯干腐病最主要的病原菌[16-17]；而由茄病镰刀菌引起的马铃薯干腐病在伊朗和南非发生严重[18]；在中国河北和内蒙古共分离到4种致病镰刀菌，其中锐顶镰刀菌(F.acuminatum)是优势分离菌[19-20]；李金花等[21]在对甘肃马铃薯镰刀菌干腐病的优势病原菌研究中发现，接骨木镰刀菌和茄病镰刀菌是优势分离种；引起黑龙江省马铃薯干腐病的镰刀菌有6种，闵凡祥等[22]在对鉴定出的镰刀菌进行致病性测试中发现，接骨木镰刀菌、燕麦镰刀菌和拟丝孢镰刀菌(F.trichothecioides)的致病力最强，拟枝孢镰刀菌(F.sporotrichioides)最弱。

本试验对新疆马铃薯镰刀菌根腐病进行调查和取样，将病样进行病原菌的分离纯化，通过形态学和分子生物学对其进行种类鉴定，并对鉴定出的镰刀菌进行致病性测定，确定引起新疆地区马铃薯镰刀菌根腐病的主要致病菌，为防治马铃薯根腐病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂12 g、蒸馏水1 000 mL；Joff修改的Bilai’s培养基：磷酸二氢钾1 g、硝酸钾1 g、氯化钾 0.5 g、七水硫酸镁0.5 g、淀粉0.2 g、葡萄糖0.2 g、琼脂12 g、蒸馏水1 000 mL；麦麸培养基：麦麸500 g、蒸馏水20 mL。

主要试剂及仪器：DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)、2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker、Gelstain、ddH2O(北京全式金生物技术有限公司)、50×TAE电泳缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)等。SPX-250生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)、T100TMThermalCycler PCR仪(时代联想生物科技有限公司)、DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、Azure Biosystems C200凝胶成像系统(北京深蓝云生物科技有限公司)、高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)、LE204E/02电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、TOMY SX-500高压灭菌器(上海麦森医疗科技有限公司)等。

1.2 马铃薯镰刀菌根腐病田间发病情况调查

2016-2017年在新疆马铃薯种植区，采用随机取样的方法对镰刀菌根腐病进行调查，本试验主要研究由镰刀菌引起的田间马铃薯块茎、根茎腐类病害，因此在调查取样中只侧重于表现为该病害症状的病样，在每个马铃薯种植区调查20株，通过观察茎基部、根及块茎上有无病斑及病斑的大小，确定镰刀菌根腐病发生的严重度，并计算病害发生率，将具有典型症状的根茎等带回实验室，保存于4 ℃冰箱中，用于病原菌的分离。

病害发生率=(发病株数/调查株数)×100%。

1.3 病原菌的分离、鉴定

1.3.1 病原菌分离纯化 用常规组织分离法对采集的病害样本进行分离[23]，利用单孢分离法对分离到的菌株进行纯化。单孢分离采用稀释平板法，刮取少许菌丝于盛有无菌水的1.5 mL离心管中混匀制成孢子悬浮液，取一滴在显微镜下进行观察，如若一个镜头下只有0～1个孢子，则取一滴该浓度下的孢子悬浮液滴于PDA培养基上，用涂布玻璃棒将其均匀涂开，待单孢长出菌丝，挑取菌丝转至新的PDA培养基上25 ℃恒温培养。

1.3.2 病原菌形态特征观察 将单孢菌株纯化后转接于PDA培养基和Bilai’s培养基上，观察菌落颜色、形状及菌丝的疏密情况，测定菌落生长4 d时的菌落直径。产孢后，在显微镜下观察分生孢子的大小、形状、数量，及产孢细胞的形状，厚垣孢子的有无及形状。根据病原菌的形态特征，依据Booth分类系统[24]，同时参考《山西镰刀菌》[25]等相关资料进行形态学鉴定。

1.3.3 基因组DNA提取 病原菌DNA采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取。首先将培养好的镰刀菌菌丝于研钵中液氮冷冻后研磨，根据试剂盒提供的方法步骤进行操作。取 5 μL DNA溶液在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳，DNA于-20 ℃保存，备用。

1.3.4 病原菌基因序列扩增及测序 采用镰刀菌属特异性引物EF-1H/EF-2T对分离到的镰刀菌进行分子鉴定。EF-1H：5′-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3′，EF-2T：5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′[26]。

对所提DNA进行PCR扩增，每个反应体系总体积为25 μL，其中模板DNA 1 μL (56 ng/μL)，上下游引物各1 μL(1 μmol/L)，2×EasyTaqPCR Super Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。

PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。将PCR产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3.5 序列数据处理及系统发育树构建 对测序结果在NCBI网站进行BLAST比对，根据比对结果从GenBank数据库获得最相似的序列，进行同源性比较，利用MEGA 5.20分析软件采用NJ法构建基于EF-1α基因序列的系统发育树，分析所分离菌株与其他菌株间的亲缘关系，确定分类地位。

1.4 病原菌致病性测定

根据柯赫氏法则对病原菌致病性进行验证[23]。分别取编号为X9-1-1、X29-1-1、X16-2-2、X16-1-3和X8-2-1的菌株进行致病性测定，将5株镰刀菌接入PDA平板培养基上培养7～10 d后，用直径10 mm的打孔器取菌饼10片，接于装有麦麸培养基的三角瓶中，25 ℃下培养9～15 d，待菌丝长满培养基后，以1∶100(质量比)比例与灭菌土混匀分别制成菌土[27]。播种马铃薯(品种‘青薯9号’)于装有菌土的花盆中，以装有无菌土的花盆为对照，每种处理3次重复，每个重复播种3株，置于温室中培养。待植株发病后观察发病情况并统计发病率，同时，采用组织分离法对病原菌进行再分离，将分离物的菌落形态、孢子形态等与接种菌株进行比较。

1.5 数据处理与分析

用Excel 2003软件进行数据整理及作图，用MEGA 5.20分析软件对基因序列进行系统发育树的构建。

2 结果与分析

2.1 马铃薯镰刀菌根腐病田间发病情况

2.1.1 田间症状 调查发现，新疆地区马铃薯镰刀菌根腐病的危害期主要为出苗期和结薯期。该病害主要危害马铃薯的根茎部位，在马铃薯储藏期也会危害薯块，称为马铃薯干腐病，均是由镰刀菌属真菌引起的病害。危害症状主要表现为根部腐烂，根基部常常缢缩，维管束褐变，茎基部出现黑褐色不规则斑块，湿度大时往往会产生白色的霉层。地上部分主要表现为植株瘦弱矮小，叶片开始枯黄萎蔫。

2.1.2 田间发生情况 对新疆15个马铃薯种植区进行病害调查发现，不同地区病害发生严重度和发生率不同。从病害发生严重度上看，十二师西山农场和尼勒克的镰刀菌根腐病发生最严重，而乌鲁木齐县板房沟乡等4个地区发生最轻。从病害发生率上看，伊宁县病害发生率高达80%，是所有调查地区中病害发生最高的，其次发生率较高的是乌鲁木齐县永丰乡和尼勒克，发生率为40%，病害发生率最低的是乌鲁木齐县板房沟乡和呼图壁县呼图壁镇两个地区，发生率为5%(表1)。

2.2 病原菌分离及形态学鉴定

2016-2017年，在新疆15个马铃薯产区采集具有典型镰刀菌根腐病症状的病株/薯198份，组织分离获得镰刀菌菌株，采用单孢法纯化分离到的菌株，共获得纯培养菌株322株。

通过对供试菌株在PDA及Bilai’s培养基上培养性状的观察及分生孢子的显微观察，对菌株进行初步的形态学鉴定，将其鉴定为5种镰刀菌。形态学鉴定虽然可以将大部分菌株区分开来，但有些菌株变异较大，仅仅依靠形态学鉴定很难将其鉴定到种的水平，因此还要依靠分子生物学鉴定。镰刀菌的形态学特征如下。

2.2.1 尖孢镰刀菌 培养4 d的菌落直径3.10 cm，菌丝白色，棉絮状、多。小型分生孢子卵形，棍棒形或椭圆形，0～1分隔；大型分生孢子较直，中间略弯曲，顶胞尖，基胞足跟明显，2～5分隔。单瓶梗产孢，产孢梗短，厚垣孢子椭圆形或球形，单个间生。

2.2.2 木贼镰刀菌 培养4 d的菌落直径5.00 cm，菌丝白色、黄褐色，棉絮状，茂盛。小型分生孢子长椭圆形、肾形及棍棒形，0～1分隔，多数无隔；大型分生孢子镰刀形，腹背稍弯曲，顶细胞渐尖，基胞足跟明显。3～7分隔，多数5分隔。单瓶梗产孢，产孢梗较短，厚垣孢子球形，单个，间生或顶生。

2.2.3 芬芳镰刀菌 培养4 d的菌落直径4.40 cm，菌丝白色，羊毛状或毡状。小型分生孢子卵圆形，0～1分隔；大型分生孢子较直，顶细胞钝，基胞足跟不明显，2～5分隔。单瓶梗产孢，产孢梗较长，厚垣孢子未见。

2.2.4 茄病镰刀菌 培养4 d的菌落直径2.50 cm，菌丝少，白色，绒状。小型分生孢子多，以椭圆形、肾形及卵形为主，0～1隔，多数1隔；大型分生孢子马特形，两端钝，略弯曲，2～5分隔，多数3隔。单瓶梗产孢，产孢梗长，厚垣孢子球形，单生或串生于菌丝中间。

2.2.5 锐顶镰刀菌 培养4 d的菌落直径4.45 cm，菌丝淡黄色，羊毛状，茂盛。小型分生孢子椭圆形、纺锤形及肾形，0～1分隔；大型分生孢子顶细胞延长，基胞足跟明显，2～5分隔，多数3分隔。单瓶梗产孢，厚垣孢子球形，单个顶生或 间生。

2.3 分子生物学鉴定

通过EF-1H/EF-2T引物对分离到的菌株进行序列测定，获得长度为711～748 bp的序列片段。将获得的DNA序列与GenBank中已登录镰刀菌的序列进行同源性比较，并用MEGA 5.20分析软件采用NJ法构建系统发育树(图1)。结果表明，编号为X8-2-1和X9-1-1的菌株与GenBank中登录号为KX094920.1的锐顶镰刀菌聚在一个分枝上，说明其亲缘关系最近，且同源性达98%，菌株X8-2-1和X9-1-1的形态学鉴定均为锐顶镰刀菌，与分子学鉴定结果一致。菌株X8-1-1和X16-2-2与登录号为HQ702585.1的芬芳镰刀菌聚在一起，同源性高达99%，与形态学鉴定结果一致，确定X8-1-1和X16-2-2菌株为芬芳镰刀菌。编号为X19-1-1的菌株与登录号为KJ647280.1和KU361443.1的尖孢镰刀菌序列的同源性为99%，且与形态学鉴定结果相一致，说明这两株菌株为尖孢镰刀菌。分离编号为X16-1-3的菌株与GenBank中登录号为KX901848.1的茄病镰刀菌的同源性为99%，与菌株X16-1-3的形态学鉴定结果一致，确定其为茄病镰刀菌。编号为X29-1-1的菌株与登录号为KP400714.1的木贼镰刀菌的同源性为99%，聚在一个分枝上，且与形态学鉴定结果一致，确定该菌株为木贼镰刀菌。通过对新疆分离到的镰刀菌菌株进行EF-1α基因序列分析，以及形态学鉴定，确定引起新疆马铃薯镰刀菌根腐病的病原菌依次为尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌、芬芳镰刀菌和木贼镰刀菌。

表1 新疆各地区马铃薯镰刀菌根腐病调查结果Table 1 Investigation of potato Fusarium root rot disease in Xinjiang

注：“+”表示发病的轻重程度，“+”发病轻、“++”发病中、“+++”发病重。

Note:“+” indicates the severity of the disease, “+” is light, “++” is medium, and “+++” is heavy.

2.4 镰刀菌种类及分离频率

对新疆15个马铃薯产区病害样本采集及分离得到的322株菌株进行形态学和分子生物学鉴定，结合两种鉴定方法将其鉴定为5种镰刀菌(图2)，其中木贼镰刀菌共分离到18株，分离频率为5.59%；茄病镰刀菌共分离到28株，分离频率为8.70%；锐顶镰刀菌分离到55株，分离频率为17.08%；芬芳镰刀菌分离到55株，分离频率为17.08%；尖孢镰刀菌分离到166株，分离频率为51.55%。从镰刀菌分离频率上看，尖孢镰刀菌为新疆地区优势分离菌种，相对于尖孢镰刀菌来说，木贼镰刀菌和茄病镰刀菌的分离频率非常低。

图1 基于 EF-1α序列构建的马铃薯镰刀菌根腐病菌系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of potato root rot Fusarium based on EF-1α sequence

图2 镰刀菌的种类及分离频率Fig.2 Species and isolation frequency of Fusarium

2.5 病原菌致病性测定

室内接种试验结果表明，对照中马铃薯幼苗(图3-a)的生长指标明显优于接种的马铃薯幼苗(图3-d)，接种后的薯苗生长受到抑制，植株矮小，叶片开始泛黄；发病植株须根开始从根尖褐变腐烂(图3-c)，须根少(图3-e)，根茎处缢缩变褐(图3-b)，茎基部出现黑褐色病斑，与采样得到的病株症状相似，而对照中马铃薯幼苗均未发病，生长良好，须根多，根茎部健康(图3-f)。依据柯赫氏法则，从接种发病马铃薯幼苗的病健交界处按照“材料与方法”中病原菌分离鉴定描述的方法重新分离、纯化和鉴定，得到的镰刀菌菌株与接种所用菌株形态一致，证明所接菌株为马铃薯镰刀菌根腐病的病原菌。

接种不同镰刀菌的马铃薯植株发病率各不相同，统计分析结果显示，发病率由高到低依次为：X16-1-3(F.solani)88.9%，X16-2-2(F.redolens)66.7%，X9-1-1(F.oxysporum)、X29-1-1(F.equiseti)、X8-2-1(F.acuminatum)均为 33.3%，说明在鉴定出的5种镰刀菌中，茄病镰刀菌和芬芳镰刀菌的致病力较强，其余3个致病力 较弱。

a和f.健康植株(对照) Healthy plant (CK)；b、c、d、e.接种菌株X16-1-3引起的病害症状 Inoculated symptoms of disease caused by isolate X16-1-3

图3 病原镰刀菌致病性测定
Fig.3 Pathogenicity identification of potato root rot

3 结论与讨论

随着马铃薯主粮化战略的提出[28]，马铃薯产业在农业发展中越来越重要，不仅能够带给农民经济效益，而且在某些地区肩负着脱贫攻坚的重要使命。作为马铃薯种植产区之一的新疆，马铃薯产业也正朝着规模化方向发展，而马铃薯镰刀菌根腐病的发生是制约马铃薯产业发展的关键因素。本研究通过对新疆地区马铃薯根腐病进行调查，结果表明马铃薯根腐病在调查的15个地区均有发生，其病害发生严重度和发生率有所不同，在所调查的地区中病害发生率最高的是伊宁县，发生率高达80%；从病害发生的严重度上看，十二师西山农场和尼勒克的发病严重度最高。新疆地处中国最西边，由于日照和热量条件充足，非常适宜马铃薯的种植，随着马铃薯在新疆的种植面积不断加大，病害的发生也越来越严重，通过上述调查发现，新疆地区的伊宁县、奇台县等地的病害发生率和严重度非常高，由于这些地方的种植户在种植马铃薯时，习惯采用种植自留种薯和外调种薯，造成马铃薯的病毒感染，加大了土传病害的发生率，加上天山丰沛的降水，使得马铃薯镰刀菌根腐病的发生也逐年加重。

镰刀菌是引起植物真菌类病害中最重要的病原菌，能够引起多种植物的根腐病[29]，马铃薯枯萎病和干腐病也是由镰刀菌的许多种引起的[30-31]，本文所指镰刀菌根腐病也包括由镰刀菌引起的马铃薯干腐病。据报道，中国大多数马铃薯种植地区都有镰刀菌根腐病的发生。李金花等[21]和何苏琴等[32]对甘肃不同地区引起马铃薯干腐病的病原菌进行分离鉴定，发现不同地区引起该病害的病原菌种类存在差异，优势病原菌也不同。陈彦云[33]对宁夏西吉地区储藏期的马铃薯进行病害调查，结果发现，引起西吉马铃薯干腐病的病原菌主要是茄病镰刀菌和接骨木镰刀菌。王丽丽等[7]对新疆乌昌地区窖藏马铃薯病害调查中发现，5种镰刀菌可以引起马铃薯储藏期镰刀菌病害，分别为锐顶镰刀菌、茄病镰刀菌、黄色镰刀菌、接骨木镰刀菌和半裸镰刀菌，而在本研究中发现引起新疆地区的病原菌主要为茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌、芬芳镰刀菌、木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌，由于采集地点不同，所以在病原菌种类上存在一定差异，说明新疆地区引起马铃薯镰刀菌根腐病的病原菌在地理位置分布上有明显的地域差异。而在中国其他地方，对马铃薯镰刀菌根腐病的研究主要集中在黑龙江[22]、内蒙古[20]、河北[19]及山西[34]等地，不同地方分离到的病原菌不同，而在同一地方由于采集地区不同，病原菌的种类也有所不同。

通过对新疆马铃薯根腐病的调查、病原菌的分离、形态学特征观察、分子生物学鉴定及致病性测定，确定引起该病害的病原菌为尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、锐顶镰刀菌、芬芳镰刀菌和木贼镰刀菌。对由镰刀菌引起的马铃薯根腐病在新疆地区报道较少，通过本试验确定引起新疆马铃薯镰刀菌根腐病的主要病原菌，为以后防治新疆马铃薯根腐病提供一定依据。