NaHCO3胁迫对甘蓝型油菜幼苗生长的影响及其耐盐候选基因预测

陶顺仙，张 燕，李 萍，燕佳琦，徐爱遐，黄 镇

(西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100)

近年来，日益严重的土壤盐碱化对作物生产产生严重影响，盐碱胁迫显著降低了作物的生产力[1-4]。根据粮农组织(FAO)的数据，世界上至少有6%的土地受到盐碱的影响，2.3亿hm2的灌溉土地中有4 500万hm2受盐碱的胁迫[5]。改良盐碱地和种植耐盐碱作物均被用于缓解土地盐碱化这一世界难题，而后者被认为是最为经济可行和最有效的方法。作物耐盐性研究发现，甘蓝型油菜中存在一些耐盐性的种质资源，是改良盐碱地的重要作物。此外，中国油菜主产区油菜播种面积也呈现逐年下滑的趋势[6-9]，急需在中国北方以及沿海地区增加油菜的播种面积[10]，但是这些地区存在大量的盐碱地，因此必须解决油菜在盐碱地正常生长的问题。

研究表明，当植株遭受盐碱胁迫时，细胞膜的原生质收缩而产生内拉外张的应力，脂质层会被拉破，使细胞膜丧失选择性，引起细胞内的电解质和非电解质大量外渗，从而破坏细胞内外离子平衡，幼苗细胞膜的受损程度与盐碱胁迫强度密切相关[11]。渗透调节也是逆境生理适应的主要机制之一，植物通过合成大量的小分子物质，如脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，帮助细胞维持一定的膨胀压力，确保光合作用、呼吸作用、细胞代谢和其他生命活动的正常运行[12-13]。植物还通过体内酶保护系统(SOD、POD、CAT)来维持植物体内活性氧(ROS)的平衡，避免ROS的积累，有效减轻ROS对植物细胞的损伤[14]。

从已有的油菜耐盐研究来看，多以NaCl胁迫作为处理方式，以Na+离子代谢、耐盐性相关基因的分子生物学及盐胁迫信息传导等为主要研究方向。但是大部分的盐碱土壤中不仅存在盐离子，还存在OH-离子，碱对植物生长的影响往往要大于盐离子的影响[15]。如果单纯的研究中性盐对植物的影响，其研究所取得成果很难有效应用于生产中，因此很有必要研究植物对碱性盐胁迫的响应机制，目前甘蓝型油菜该方面的研究并不多。因此，本试验通过人工模拟碱性盐胁迫，对甘蓝型油菜苗期耐盐性相关生理指标进行测定，研究其变化规律。同时利用qRT-PCR技术研究耐盐相关基因的表达量变化，分析生理指标和基因表达量的相关性，初步确定甘蓝型油菜抗碱性盐可能的候选基因。本试验将为甘蓝型油菜耐碱性盐育种及耐碱性盐机理的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料、碱胁迫处理和取样

选取籽粒饱满、大小一致的耐盐品系‘2205’和敏盐品系‘1423’种子在25 ℃下催芽4 d，光周期为12 h，然后将其移入基质。在受控条件下[16 h光照(25 ℃)/8 h黑暗(20 ℃)循环；光照度为10 000 lx，相对湿度60%～90%]，幼苗长到三叶期左右移入到含有75 mmol/L NaHCO3营养液中处理0、12、24 h(2个品系胁迫前后的表型见图1)，分别取叶片于2 mL试管，每个品系在各个时间取样，3次重复。将收集的幼嫩叶片立即放在液氮中冷冻，在-80 ℃下储存用于生理指标测定以及基因表达量分析。

1.2 耐盐相关基因的表达量分析

根据已经公布的甘蓝型油菜基因注释，在甘蓝型油菜数据库(http://www. genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/)中选择6个与植物耐盐相关的基因，见表1。

图1 NaHCO3胁迫(0 h、24 h)对甘蓝型油菜幼苗表型的影响Fig.1 Effects of NaHCO3 stress on phenotype of Brassica napus L. seedlings

表1 基因编号及GO注释Table 1 Genes number and GO annotation

为了研究6个耐盐基因在碱性盐NaHCO3胁迫下的表达模式，采用RT-qPCR方法检测NaHCO3胁迫后这些基因在耐盐品系‘2205’和敏盐品系‘1423’中不同时间点(0、12、24 h)的相对表达量。具体方法如下：用Primer 5.0设计特异性引物，引物由上海生工合成。根据天根生化科技有限公司RNA提取试剂盒提取不同时间点幼嫩叶片中的总RNA，检测完整性和浓度，然后按照天根FastQuant RT试剂盒合成cDNA。以甘蓝型油菜为内参，cDNA链为模板，参照SYBR Green RT-PCR说明书进行实时荧光定量检测。每个样品进行3个技术重复，采用2-△△Ct法进行相对表达量的计算。

1.3 相关生理指标的测定

1.3.1 细胞膜透性 参考文献[16]，将各个时间点的叶片用自来水洗净并擦干，然后用打孔器打取9个圆叶片，然后放入加有10 mL去离子水的试管中，振荡12 h，测其浸泡液电导率S1，再将试管封口置沸水浴中20 min，冷却至室温，摇匀后测其煮沸后浸泡液电导率S2，每个处理3个 重复。

1.3.2 可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸质量分数及SOD和POD活性 取各个时间点油菜幼苗的叶片0.2 g，液氮研磨，1 mL(pH=7.8)磷酸提取液二次研磨，2 mL+2 mL磷酸提取液进行冲洗到10 mL离心管中。4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清液为待测液，每个处理3个重复。采用茚三酮比色法测定脯氨酸质量分数[16]，蒽酮法测定可溶性糖质量分数[17]，考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质量分数[17]，氮蓝四唑还原法测定SOD活性[17]，愈创木酚显色法测定POD活性[17]。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016软件对NaHCO3处理后每个时间点的生理参数 和基因表达量进行多重比较(LSD)和相关性 分析。

2 结果与分析

2.1 NaHCO3胁迫后甘蓝型油菜幼苗耐盐基因表达量分析

如图2所示，在NaHCO3胁迫后0、12、24 h，Bna23780D、Bna00850D、Bna12880D、Bna174 10D基因在耐盐品系‘2205’的表达量高于敏盐品系‘1423’，而Bna24820D基因在耐盐品系‘2205’的表达量低于敏盐品系‘1423’；Bna19240D基因在NaHCO3胁迫早期(0 h、12 h)，耐盐品系表达量高于敏盐品系，胁迫后期(24 h)敏盐品系表达量高于耐盐品系。其中，Bna17410D和Bna12880D基因的表达量呈现先上升后下降的趋势，在NaHCO3处理12 h后，基因表达量达到最大；Bna19240D、Bna23780D、Bna24820D、Bna00850D基因呈现一直上升的趋势，在NaHCO3处理24 h后表达量达到最大。

2.2 碱性盐NaHCO3胁迫下甘蓝型油菜幼苗的生理反应

2.2.1 细胞膜对油菜耐碱性盐(NaHCO3)的反应分析 如图3所示，在NaHCO3处理后，两品系的电导率均升高，而敏盐品系‘1423’的上升趋势更为明显，12 h后与对照的差异达到显著水平，24 h后达到极显著水平。在耐盐品系中，NaHCO3处理12 h、24 h后，耐盐品系‘2205’的电导率与对照相比显示出无显著差异，这表明NaHCO3胁迫下敏盐品系‘1423’幼苗的膜损伤更为严重。

2.2.2 抗氧化酶对油菜耐碱性盐(NaHCO3)的反应分析 图4的结果表明NaHCO3胁迫下，两品系幼苗叶片的SOD、POD活性随时间的延长呈升高的趋势，在24 h均达到最大值。碱性盐NaHCO3处理12 h、24 h后，耐盐品系‘2205’幼苗叶片的SOD活性分别显著升高了60%和1倍，而敏盐品系‘1423’的SOD活性分别增加了34%和43%，这表明NaHCO3胁迫下同一时间点耐盐品系‘2205’的SOD活性高于敏盐品系‘1423’。此外，NaHCO3处理12 h、24 h后，耐盐品系‘2205’幼苗叶片的POD活性较0 h分别升高18%和35%，而敏盐品系‘1423’的POD活性增加了12.6%和28%，这表明NaHCO3胁迫下同一时间点耐盐品系POD活性也高于敏盐品系。以上结果说明，耐盐品系‘2205’的耐NaHCO3能力强于敏盐品系‘1423’，而且SOD酶活性对碱性盐NaHCO3胁迫更为敏感。

2.2.3 渗透调节物质对油菜耐碱性盐(NaHCO3)的反应分析 图5结果表明，NaHCO3处理后，耐盐与敏盐品系叶片的脯氨酸质量分数随着时间的增加呈升高的趋势，24 h时均达到最大值，耐盐品系‘2205’与对照相比增加1.8倍，敏盐品系‘1423’脯氨酸质量分数增加了53%，其与对照差异达到极显著或显著水平。如图6所示，2种油菜幼苗叶片的可溶性蛋白质量分数随着NaHCO3胁迫时间的增加而略有升高，NaHCO3处理12 h后，耐盐品系‘2205’中溶性蛋白质量分数升高了3.7%，同时敏盐品系升高了4.5%，均与对照无显著差异；胁迫24 h后，耐盐品系与敏盐品系中的可溶性蛋白质量分数分别升高 22.4%和11.2%，其与对照差异分别达到极显著或显著水平。如图7所示，在NaHCO3处理后，两品系的可溶性糖质量分数均升高，而耐盐品系‘2205’的上升趋势更为明显，24 h后与对照的差异达到极显著水平，可溶性糖的质量分数增加了1倍。在敏盐品系中，NaHCO3处理24 h后，叶片中可溶性糖质量分数与对照相比极显著增加37.6%，差异也达到极显著水平。图5、图6和图7结果均表明NaHCO3胁迫激活了植物体内渗透调节物质对逆境的生理反应。

大写字母表示在1%水平上差异显著，小写字母表示在5% 水平上差异显著，下同 Uppercase letters indicate significant difference at 1% level,lowercase letters indicate significant difference at 5% level,the same below

图2 NaHCO3胁迫下甘蓝型油菜叶片耐盐基因的表达分析
Fig.2 Expression analysis of salt-tolerant genes inBrassicanapusL. leaves under NaHCO3stress

图3 不同时间点甘蓝型油菜品系叶片的质膜透性Fig.3 Leaf membrane permeability at different times in the Brassica napus L. cultivars

2.3 甘蓝型油菜逆境基因相对表达量与耐碱性盐相关生理指标的相关性分析

为了初步判断所选基因是否为耐碱性盐候选基因，笔者利用SPSS 20.0软件分析耐盐与敏盐品系在NaHCO3胁迫后0、12、24 h幼苗叶片中耐盐基因表达量与电导率、抗氧化物酶(SOD、POD)活性、脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性糖质量分数的相关性。如表2所示，Bna12880D和Bna17410D基因的表达与两品系的各生理指标的变化不存在相关性；Bna23780D基因的表达量与敏盐品系‘1423’的超氧化物歧化酶(SOD)活性呈极显著正相关，Bna24820D基因的表达量与敏盐品系‘1423’的质膜透性(EC)存在显著相关性，与可溶性糖质量分数呈极显著正相关。Bna19240D基因和Bna00850D基因的表达与两品系的逆境生理指标存在相关性，其中Bna19240D的表达量与耐盐品系‘2205’的可溶性蛋白质量分数存在显著相关，与敏盐品系‘1423’中质膜透性(EC)和脯氨酸(Pro)质量分数的变化呈显著相关性；Bna00850D基因的表达量与两品系中大部分生理指标的变化都存在相关性，与耐盐品系‘2205’中的质膜透性(EC)和可溶性糖(SS)质量分数呈显著正相关，与敏盐品系‘1423’中的抗氧化酶(SOD、POD)活性、脯氨酸(Pro)质量分数的变化存在显著相关性。根据此结果，初步推断Bna00850D基因可能是甘蓝型油菜耐碱性盐NaHCO3的一个候选基因。

图4 NaHCO3胁迫下甘蓝型油菜幼苗叶片POD和SOD活性Fig.4 POD and SOD enzyme activity in leaves of Brassica napus L. seedlings under NaHCO3 stress

图5 NaHCO3胁迫下甘蓝型油菜幼苗叶片脯氨酸质量分数Fig.5 Mass fraction of soluble proline in leaves of Brassica napus L. seedlings under NaHCO3 stress

图6 NaHCO3胁迫下甘蓝型油菜幼苗叶片可溶性蛋白质量分数Fig.6 Mass fraction of soluble protein in leaves of Brassica napus L. seedlings under NaHCO3 stress

图7 NaHCO3胁迫下甘蓝型油菜幼苗叶片可溶性糖质量分数Fig.7 Mass fraction of soluble sugar in leaves of Brassica napus L. seedlings under NaHCO3 stress

表2 耐盐基因表达量与电导率、抗氧化物酶(SOD和POD)活性、渗透调节物质(Pro、SS和SP)质量分数间的相关关系Table 2 Correlation between salt-tolerant genes expression and stress physiology related indexes

注：“**”表示在1%水平上显著相关；“*”表示在5%水平上显著相关。

Note:“**” is significantly correlated at 1% level;“*” significant correlation at 5% level.

3 讨论与结论

本试验研究了碱性盐NaHCO3胁迫后叶片生理指标的变化，这将为甘蓝型油菜耐碱性盐分子机理的研究提供生理参考依据。质膜透性可以用来反映细胞膜损伤的程度[24]，植株遭受非生物胁迫时，细胞内的电解质和非电解质大量外渗，使浸泡液的电导率有所增加。在本研究中碱性盐NaHCO3胁迫后甘蓝型油菜幼苗叶片的电导率升高，胁迫时间越久，细胞膜损伤越严重，敏盐品系‘1423’幼苗的膜损伤更为严重，这与刘自刚等[25]研究NaCl胁迫对白菜型冬油菜种子萌发和幼苗生理的影响的结果大致相同。植物体内通过积累脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等一些渗透调节物质来抵抗盐碱胁迫[25-27]。本试验中，随着NaHCO3处理时间的延长，2种甘蓝型油菜幼苗叶片中脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖质量分数增加，而且耐盐品系中渗透调节物质(Pro、SP)的质量分数高于敏盐品系，这可能是耐盐品系保持较良好的胞内生理状态，有效地抵抗了盐碱胁迫引起的水分胁迫。其次，在植物细胞所能忍受的活性氧范围内，植物也能够通过活性氧清除系统抵御碱性盐胁迫[28]，NaHCO3胁迫诱导甘蓝型油菜幼苗叶片抗氧化酶(SOD、POD)活性的升高，SOD活性对碱性盐NaHCO3胁迫更为敏感，这些表明SOD和POD是该甘蓝型油菜品系碱胁迫下清除活性氧的重要酶类，在黄瓜和西瓜耐碱性盐NaHCO3的研究中也有类似的结果[20，29]。

其他一些植物耐盐研究探究了盐胁迫下燕麦[30]和胡杨[31]叶片中生理指标以及耐盐相关基因表达量的变化趋势，结果发现生理指标的变化与基因表达量的变化密切相关，从而推测这些基因影响了对应生理指标的变化，因此可以通过这种方法初步推测哪些耐盐基因是甘蓝型油菜耐碱性盐NaHCO3可能的候选基因。本试验将甘蓝型油菜数据库中的6个耐盐基因在碱性盐胁迫下进行表达量分析，Bna23780D、Bna00850D、Bna12880D、Bna17410D基因在耐盐品系‘2205’的表达量高于敏盐品系‘1423’，而Bna24820D基因在耐盐品系‘2205’的表达量低于敏盐品系‘1423’。对6个基因相对表达量与生理指标的进行相关性分析，Bna00850D基因的表达量与两品系中大部分生理指标的变化都存在相关性，因此初步推断Bna00850D基因可能是甘蓝型油菜耐碱性盐NaHCO3的候选基因，同时有研究表明，植物体内的谷胱甘肽在抵抗各种胁迫(冷害、干旱)的过程中起重要作用，而Bna00850D基因可能通过调节线粒体内的羟基谷胱甘肽水解酶活性(GO：0004416)、谷胱甘肽硫酯酶活性(GO：0047951)以及硫双加氧酶活性(GO：0050313)对盐胁迫做出反应(GO：0009651)[32]。Bna00850D基因是否是甘蓝型油菜耐碱性盐NaHCO3的候选基因，最终需要对Bna00850D基因进行功能验证，该工作目前正在西北农林科技大学农学院油菜遗传及分子育种实验室进行。