枸杞种间杂交F1 群体的SSR鉴定及遗传分析

尹 跃，赵建华，何昕孺，梁晓婕，安 巍，秦小雅，曹有龙

(宁夏农林科学院 国家枸杞工程技术研究中心，银川 750002)

中国是枸杞(LyciumbararumL.)原产地和最大生产国。枸杞属于异花授粉，存在杂合度较高、杂交后代性状不稳定等问题。目前，通过人工杂交选育的品种仅有‘宁杞菜1号’[1]，而推广种植面积大的品种‘宁杞1号’‘宁杞5号’‘宁杞7号’和‘宁农杞9号’等[2-5]新品种都是通过群体选优，使得枸杞品种资源间的遗传结构狭窄，遗传多样性较低[6-8]。杂交育种是常规育种手段，促进亲本基因重组，创造丰富的遗传变异。相比较其他茄科植物，如番茄、辣椒等[9-10]，枸杞杂交育种还存在育种方法和技术的滞后，育成中间材料少等问题。因此，要充分重视枸杞杂交育种工作，创制更多育种中间材料，充分挖掘和利用中国野生枸杞资源的优势。

杂种鉴定是杂交育种一项重要工作环节，其主要目的是降低育种成本，提高育种效率。传统的杂种鉴定方法有形态学和细胞学等[11-12]，这些方法具有周期长及成本高等特点。随着高通量测序技术和生物信息学快速发展，分子标记(SSR和SNP)技术日趋完善，为快速完成杂种鉴定提供技术支撑。SSR标记具有共显性遗传、多态性高和重复性好等优点，已广泛应用于龙眼、沙田柚、月季、老芒麦、黄麻和马铃薯等[13-17]植物杂交后代鉴定，但在枸杞杂交种鉴定方面还没有报道。本研究以黄果枸杞(P1)为父本，北方枸杞(P2)为母本，进行人工杂交获得91个F1单株遗传分离群体。采用SSR分子标记技术对该群体进行杂种真实性鉴定和遗传变异分析，以期为进一步利用该群体开展遗传学研究和分子辅助育种提供材料和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杂交亲本材料以黄果枸杞(L.bararumvar.auranticarpum，以P1表示)为父本，北方枸杞(L.chinensevar.potaninii，以P2表示)为母本，二者杂交获得F1代91个单株(用F1-2，F1-3，……，F1-187表示)，全部定植于宁夏农林科学院国家枸杞种质库(38°38′49″N，106°9′10″E)。2017年4月采集幼嫩叶片，立即放入液氮中保存，带回实验室提取DNA。

66对SSR引物序列来源枸杞全基因组测序所开发，由国家枸杞工程技术研究中心功能基因实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取及检测 采用试剂盒法(天根，DP305-02)提取基因组DNA，10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，用分光光度计(Eppendorf,BioPhotometer plus)将工作液质量浓度稀释至100 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增检测体系 PCR扩增反应在ABIGene Amp 9600 PCR扩增仪上进行。扩增体系15 μL：DAN模板1 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTP 0.6 μL，上下游引物各0.2 μL，Taq酶 0.1 μL，M13引物1 μL，最后用ddH2O补足至15 μL。扩增程序：94 ℃变性5 min； 94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；94 ℃ 变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，15个循环；最后60 ℃延伸30 min。

扩增产物检测：取1 μL PCR扩增产物，加入到含有9 μL(0.5∶8.5)分子量内标和甲酰胺混合液的96孔板中，95 ℃变性3 min，ABI3730上机检测。

1.2.3 杂交后代的SSR鉴定 利用66对SSR引物对亲本及随机挑选2个F1单株进行扩增，筛选出具有双亲互补型杂合位点的引物用于杂交后代鉴定，扩增结果中具有双亲特异位点杂交后代即为真杂种[13]，对于双亲位点缺失杂交后代需要进行重复性验证。

1.2.4 杂交后代遗传分析 利用GeneMapper 4.0软件获取扩增产物片段大小，用DataFormater 2.7软件[18]进行标准化整理并转化为NTSYS-pc 2.10软件[19]输入格式，并由该软件计算Nei 72遗传距离。将Nei 72遗传距离矩阵导入MEGA 6.06[20]软件，采用UPGMA法构建聚类图，最后使用iTOL软件(https://itol.embl.de/)在线编辑美化。

2 结果与分析

2.1 杂交后代获得

2015年5-6月采用常规杂交方法进行杂交，以‘黄果枸杞’为父本，‘北方枸杞’为母本，将获得杂交种子于2015年11月在温室进行催芽、播种和穴盘育苗。2016年4月移栽至田间，株行距为0.5 m×3 m，统一肥水管理水平。从定植幼苗到结果期间有部分杂交后代死亡，最后获得成活杂交后代91个F1单株。观察其果实性状变异，果实有红色长柱形、黄色长柱形、黄色近圆形和红色近圆形等，表型变异丰富(图1)。

2.2 特异性引物筛选

66对SSR引物在父母本及随机挑选的4个子代中进行扩增，筛选出双亲互补型特异位点引物6对(表1,图2 )，利用这6对引物进行杂交后代鉴定分析。

A为杂交亲本 Parents，P1为父本 Male，P2为母本 Female；B为部分杂交后代 Some of hybrid offspring

引物名称Primer name重复单元Repeats上游引物序列(5'→3')Forward primer sequence下游引物序列(5'→3')Reverse primer sequenceLBSSR0001(AGA)17TTTCTATGCTGGATAGGATTCCTAGACCCAAATACTGCCTTCTTAACCLBSSR0046(ATG)13TTCGAGTCCATGTTTACTAAGAGCTCTCATAAGCTTCGGAGTCTCTGLBSSR0103(ATA)16GGTTCAACATACAGACAGTCCTACAACTAGAACTTCCGATCCTTCCAGLBSSR0249(TTC)14CTCTGAGTGCGTCCACTTGAGACAATGGTTGAACGAGTGAGAAGLBSSR0256(TTC)21TCATCTTCTCACTTGCAATTACAGTGATGAACTGCTAGTGAGCTTGALBSSR0276(GAA)16GAAGATAAAGGGAAAGACATGGTTTTACTTCCAATTCACGCTTCA

A为引物LBSSR0001 Primer LBSSR0001; B为引物LBSSR0046 Primer LBSSR0046; C为引物LBSSR0103 Primer LBSSR0103; D为引物LBSSR0249 Primer LBSSR0249; E为引物LBSSR0256 Primer LBSSR0256; F为引物LBSSR0276 Primer LBSSR0276

图2 双亲互补型杂合位点
Fig.2 Parental complementary heterozygous loci

2.3 F1 群体SSR的鉴定

利用筛选出6对双亲互补特异位点的引物对91个单株进行扩增，扩增结果显示：91个单株中，其中有83个单株在6个SSR位点上都有双亲互补型杂合位点(图3)，可被认定为真杂种，杂种率为91.2%，8个单株出现异常SSR基因型(表2)。

图3 6对SSRs引物对单株F1 -2扩增结果Fig.3 Amplification results of six pairs of SSRs primer for F1 -2

在8个F1单株基因型中，有5株在引物LBSSR0256出现一条带为父本带，另一条带为新扩增条带；2株(F1-29、F1-104)在引物LBSSR0046和LBSSR0276中出现一条为母本带，另一条为新扩增条带；1株F1-173号在LBSSR0046、LBSSR0249、LBSSR0256和LBSSR0276这4个位点中均出现1个亲本1条带，另一个亲本2条带，推测其可能为3倍体或非整倍体，需要结合细胞学实验进一步验证。

2.4 亲本与F1 群体的聚类分析

根据SSR鉴定结果，剔除出现异常基因型的8个单株。根据6对引物在2个亲本和83个单株扩增结果构建(0，1)矩阵，计算供试材料间Nei72遗传距离，采用UPGMA法构建聚类图(图4)。结果显示：2个亲本间的遗传背景较大，遗传距离为0.98；83株F1杂种间的遗传距离为0.00～0.75。在遗传距离为0.712处可将83株F1划分为2大类：第Ⅰ大类与父本聚类在一起，共38株，占45.8%；第Ⅱ大类与母本聚类在一起，共45株，占54.2%。在遗传距离为 0.636处可进一步将第Ⅰ类F1细分为2个亚类，第Ⅱ类F1细分为2个亚类。聚类分析结果表明，杂交后代产生了广泛的遗传变异，多样性丰富。

表2 6对引物检测到杂交后代异常基因型Table 2 Six pairs of primers detected abnormal genotypes of hybrid offspring

图4 杂交亲本与F1 代聚类图Fig.4 Dendrogram of parents and eighty-three progenies

3 讨 论

3.1 杂交后代真实性鉴定

随着高通量测序技术和生物信息学技术快速发展，大量SSR标记被开发及应用于杂交后代鉴定[16-17]，由于SSR标记呈现共显性，理论上选用1对特异性引物就可以鉴定出真假杂种，真杂种表现为双亲互补型[13]。本试验利用筛选出6对杂合显性引物对91个F1单株鉴定，其中8个F1单株出现异常基因型(父本特异条带缺失或新增条带)，其余83株均为真杂种，杂种效率为 91.2%。条带缺失可能是由于配子形成过程中染色体的交换及DNA分子碱基修饰引起的突变[13]。另外，F1-173在4个SSR位点(LBSSR0046、LBSSR0249、LBSSR0256和LBSSR0276)出现1个亲本1条带，另一个亲本2条带，其推测可能为非整倍体，需要结合细胞学进行鉴定证实。本试验首次基于枸杞全基因组序列开发的SSR标记对枸杞杂交后代鉴定，将为杂交群体保存及开展高密度遗传图谱构建奠定基础。

3.2 亲本与杂交后代遗传多样性分析

性状遗传分离是杂交育种的重要基础。枸杞杂交育种工作起步较晚，杂交后代性状遗传规律研究滞后。何军等[21]研究表明，枸杞杂交后代果实大小性状属于数量性状。本试验中2个亲本间的遗传差异较大，遗传距离为0.98。这与本课题组前期利用iPBS进行枸杞种质资源多样性分析中‘北方枸杞’与‘黄果枸杞’亲缘关系较远的结果相一致[22]。北方枸杞果色为黄色，果形为长柱形，平均单果质量为0.7 g，果形指数为2.5；黄果枸杞果色为黄色，果形为圆形，平均单果质量为0.34 g，果形指数为1.4。通过杂交，其杂交后代产生了显著的遗传变异。在遗传距离为0.712处，将83个真杂种分为2大类，第Ⅰ大类与父本聚为一类，占45.8%，第Ⅱ大类与母本聚为一类，占54.2%。杂种间存在丰富遗传多样性。田间表型观察结果，F1代果实表现为黄色长柱形、红色近圆形等，果实性状分离明显。这将为下一步利用该群体构建高密度分子遗传图谱，开展果色性状精细定位和相关基因挖掘研究提供参考，以期解析枸杞果实颜色性状遗传调控。