消化离心沉淀涂片法在痰找抗酸杆菌中的应用

周清林，王辉，曾红平，陈丽红，唐裕后，许春华，陈旺国

江西省广昌县人民医院检验科 （江西广昌 344900）

肺结核是由结核分枝杆菌复合群引起的慢性传染性疾病，其发病率和病死率均呈现逐年增加的趋势[1]，严重威胁人类的健康。及早确诊并接受规范的药物治疗是肺结核患者治愈的关键[2]。痰标本直接涂片法操作简单、价格低廉，在我国被广泛用于肺结核的诊断[3]，但其灵敏度低，涂阳患者漏检现象严重，难以满足新形势下结核防控策略的需求[4]。本研究运用消化离心沉淀涂片法查找痰液中的抗酸杆菌，就其检出结果与直接涂片法、荧光染色镜检法进行对比分析，以确定该方法的临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年12月至2019年5月江西省广昌县人民医院送检的192例痰标本，其中男109例，女83例；年龄15～82岁，平均（54.05±5.66）岁。每份标本同时采用消化离心沉淀涂片法、直接涂片法和荧光染色镜检法查找抗酸杆菌。

1.2 方法

本研究所用仪器与试剂包括：奥林巴斯CX23生物显微镜、明美生物荧光显微镜、GENIUS 6K-C离心机、微型旋涡混合仪，珠海贝索的抗酸染色液、抗酸荧光显色试剂、4%NaOH溶液。

消化离心沉淀涂片法：吸取痰液2～3 ml于灭菌离心管中，加入1～2倍体积的4%NaOH 溶液，振荡混匀30～60 s；室温静置15～20 min，待检体完全融化后，3 000 r/min 离心10 min；吸去上清液，混匀管底沉淀物，取沉淀物1滴（约50 μl）于玻片中央，均匀涂成10 mm×20 mm卵圆形痰膜，自然干燥和火焰固定后进行抗酸染色；滴加苯酚复红2～3滴，加热3～5 min，待涂片冷却后水冲洗；3%盐酸酒精脱色30～60 s，水冲洗；碱性美兰溶液复染1 min，水洗。

直接涂片法：用竹签茬端挑取痰标本中干酪样或脓样等异常部分0.05～0.1 ml，于玻片正面右侧2/3处均匀涂成10 mm×20 mm的卵圆形痰膜；痰膜朝上静置自然干燥后（一般约需要30 min）[5]，进行抗酸染色。

荧光染色镜检法：痰标本用直接涂片法制片，自然干燥后，火焰固定；滴加金胺“O”染液于涂片上，37 ℃染色15 min，水洗；脱色液脱色1～2 min，水洗，直至肉眼观察无色为止；复染液复染3～4 min，水洗。

1.3 临床评价

比较3种方法的阳性检出率，探讨消化离心沉淀涂片法在痰找抗酸杆菌中的优越性。染色后镜检及结果报告依照《中国结核病防治规划、痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》规定的标准执行[6]。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.O统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

消化离心沉淀涂片法、荧光染色镜检法阳性检出率均高于直接涂片法，差异有统计学意义（P＜0.05）；消化离心沉淀涂片法与荧光染色镜检法阳性检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 192例标本3种方法阳性检出率比较

3 讨论

有文献报道，受技术操作等多方面因素影响（如含血液的痰标本、口腔中的杂物、人为染色的差异性等[7]），传统痰涂片方法阳性检出率较低，容易出现漏检。传统痰涂片检查中，有40%以上的成人肺结核及75%肺外结核患者的检查结果为阴性，且传统痰涂片检查无法对潜伏期感染做出诊断[8]。而消化离心沉淀涂片法在直接涂片法的基础上，对痰标本进行消化溶解离心处理，提高了抗酸杆菌的阳性检出率。消化离心沉淀涂片法主要有以下优点：（1）采用4%NaOH溶液作为溶痰剂消化痰液，既能降低抗酸杆菌的活性，又可杀死非分枝杆菌，避免在涂片染色过程中，因残存在痰液中的病原菌挥发，危害操作者及周围人员的健康；（2）4%NaOH溶液可以更加彻底地溶解痰液中上皮细胞、黏液、血液等蛋白成分，有利于菌体的释放，涂片背景更干净，镜检更加清晰易辨；（3）消化后的痰标本经过离心沉淀，抗酸杆菌集聚于离心管底，实现了菌体的极大浓缩，有利于抗酸杆菌的检出。

荧光染色镜检法使用LED荧光显微镜镜检，先以20×物镜、10×目镜观察，发现疑似结核分枝杆菌的荧光杆状颗粒后用40×物镜确认；暗色背景下，抗酸杆菌呈橙色或黄色闪亮发光，菌体形态稍弯曲，有的有分枝[9]，因此荧光染色镜检法诊断性能明显优于普通的光学显微镜。荧光染色镜检法在2011年就得到WHO的认可和推荐。但荧光染色镜检法的成本在3种方法中最高。在荧光染色条件下，分枝杆菌与某些杂质在镜下都呈现为同样的黄色杆状或短棒状，而不是萋尼染色条件下的红色与蓝色背景的明显区分，这对操作者的镜检技术水平要求较高，镜检技术水平较低的人员可能无法完全辨别分枝杆菌与其他杂质[10]。

本研究结果显示，消化离心沉淀涂片法具有荧光染色镜检法相似的阳性率，而且有5例消化离心沉淀涂片法检测阳性的标本，荧光染色镜检法检测却为阴性。这可能是因为消化离心沉淀涂片法对标本进行了消化溶解离心处理，提高了标本中抗酸杆菌的菌量，更容易检出。有2例荧光染色镜检法检测为阳性的标本，消化离心沉淀涂片法检测却为阴性，其原因可能是患者长期服用抗结核药物，分枝杆菌的抗酸性被破坏，但荧光染色性被保留，因而抗酸染色阴性，而荧光染色阳性。

消化离心沉淀涂片法的操作关键：标本量应以2～3 ml为宜，量大则难以消化；把握好离心速度和时间，不宜过慢、过短；涂片时宜薄不宜厚，需自然干燥，不能加热烤干，否则染色时痰膜容易被流水冲掉，降低镜检阳性率。

综上所述，消化离心沉淀涂片法具有成本低廉、操作简单、阳性检出率高的特点。