卵巢上皮性癌中RNA结合基序蛋白3及环氧化酶-2的表达与意义

曾丹，华金仁，安云婷（通信作者）

江西省妇幼保健院 （江西南昌 330006）

卵巢上皮性癌是一种妇科常见恶性肿瘤，易转移至腹腔内，具有较高的病死率。卵巢上皮性癌的发生、发展、转移与心血管的生成密切相关。有研究指出，环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）与肿瘤的新生血管生成之间有密切的关系[1]；RNA结合基序蛋白3（RBM3）可通过改变细胞微小RNA水平进而控制球蛋白表达水平，从而影响肿瘤的发生、进展[2]。本研究通过采用免疫组化法检测卵巢上皮性癌中RBM3和COX-2的表达，探讨RBM3和COX-2在卵巢上皮性癌诊断中的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年9月至2019年5月江西省妇幼保健院收治的卵巢上皮性癌患者100例，同时选取同期的良性卵巢上皮性肿瘤患者和正常卵巢组织患者各100例，所有患者的石蜡组织标本均经手术病理学确诊。卵巢上皮性癌组年龄24～79岁，平均（51.51±3.35）岁；良性卵巢上皮性肿瘤组年龄24～78岁，平均（50.48±3.26）岁；正常卵巢组织患者年龄23～78岁，平均（51.26±3.41）岁。3组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。患者均知晓研究内容并自愿签署知情同意书。

排除标准：合并重症肝肾功能障碍的患者；不能配合研究的患者。

1.2 方法

3组均采用免疫组化法检测RBM3和COX-2。

COX-2检测：采用二步法行免疫组化染色，使用上海研生生化试剂有限公司提供的COX-2兔抗人单克隆抗体及即用型快速免疫组化MaxVisionTM 试剂盒；石蜡切片厚度4 μm，用二甲苯对切片行脱蜡处理，用梯度乙醇行脱水处理，对抗原进行高温修复，用PBS缓冲溶液冲洗，放置于湿盒；分别滴加抗COX-2，在37 ℃下孵育1 h后用PBS冲洗；之后滴加MaxVisionTM 试剂，在37 ℃下孵育15 min，用 PBS冲洗；然后用DAB染色4 min，之后用自来水冲洗；用苏木素复染，最后用自来水冲洗返蓝；用梯度乙醇冲洗至透明后封片。

RBM3检测。（1）蜡块筛选：从玻片库挑选具体病例的玻片，于显微镜下筛查，挑选最佳免疫组化玻片，标记并登记详细的玻片信息；之后挑选蜡块库中对应蜡块，按照规范要求制作组织切片。（2）高压抗原修复方法：先经二甲苯做脱蜡处理常规组织玻片，之后放入梯度乙醇脱水，并放入到蒸馏水中，留作备用；取pH值为6.0的柠檬酸缓冲液800～1 500 ml，放入压力锅内，加热直至压力锅沸腾；预先经过脱蜡处理的切片置于不锈钢切片架上，放入已经煮沸的缓冲液中；再次加热至喷气，计时1～2 min后冷却至室温，取出玻片，蒸馏水冲洗2次；用pH值为7.2～7.4的PBS冲洗2次，每次3 min。（3）免疫组化染色：切片脱蜡后，冲洗干净，放入塑料栏，用蒸馏水冲洗1遍，倒入柠檬酸液，放入微波炉中行抗原修复；取出后冷却15 min，倒掉柠檬酸液，用蒸馏水冲洗1遍，在试剂盒中画圈，后用 PBS冲洗1遍，滴加过氧化氢，室温下孵育10 min；用PBS冲洗 3 min×3遍，去掉 PBS 液，切片加一抗；于室温环境下进行为期4 h的孵育；PBS冲洗 3 min×3遍，加增强剂 A，室温下孵育20 min；PBS 冲洗3 min×3遍，加二抗，室温下孵育30 min；PBS 冲洗3 min×3遍，甩去 PBS 液，切片加100 μl或2滴DAB；PBS 冲洗1 min×3遍后，用蒸馏水冲洗、苏木素复染，之后用0.1%盐酸分化、自来水冲洗，PBS冲洗返蓝；用蒸馏水冲洗、梯度乙醇脱水、干燥，用中性树胶做封片处理。

1.3 临床评价

比较RBM3和COX-2在3组中的表达情况。阳性标准：RBM3染色胞核出现棕黄色颗粒判定为阳性细胞；COX-2免疫组化反应物质均位于细胞质，在400倍光镜下至少有10个视野，且阳性细胞数≥10%，判定为阳性。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计量资料以x-±s表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组COX-2阳性率比较

COX-2在卵巢上皮性癌组中的阳性率高于良性卵巢上皮性肿瘤组和正常卵巢组织组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 3组COX-2阳性率比较

2.2 3组RBM3阳性率比较

RBM3在卵巢上皮性癌组中的阳性率高于良性卵巢上皮性肿瘤组和正常卵巢组织组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 3组RBM3阳性率比较

3 讨论

环氧化酶也称为前列腺素过氧化合成酶，为前列腺素合成的重要限速酶，主要包括COX-1、COX-2。COX-2是一种细胞因子诱导酶，一般在正常组织中无表达，而在炎症、肿瘤等一定的诱导条件下可表现为高表达。有研究表明，COX-2的过度表达与卵巢癌、直肠癌、前列腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关[3]。COX-2参与了肿瘤的各种生物学行为，包括促进血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤黏附和转移、抑制免疫等多个环节。本研究结果显示，COX-2在卵巢上皮性癌组、良性卵巢上皮性肿瘤组中的阳性率明显高于正常卵巢组织组，且COX-2在卵巢上皮性癌组中的阳性率明显高于良性卵巢上皮性肿瘤组，可见COX-2在正常卵巢组织中不表达，且COX-2在卵巢上皮性癌中的表达高于良性卵巢上皮性肿瘤，提示COX-2的表达升高与肿瘤的分化程度和分期密切相关[4]。COX-2主要在细胞质中表达，初步设想可经免疫电镜等技术准确定位细胞器种类，并为临床提供针对性的诊治方案。

RBM3是一种富含甘氨酸的蛋白，含有一个RNA识别基序（RBM3），在卵巢癌组织中呈现异常表达，其可能参与了卵巢癌血管的生成，并对卵巢癌的发生、发展具有促进作用[5]。RBM3还被认为是一种潜在原癌基因，主要是因为其表达水平受肿瘤分期的影响，且其发生与肿瘤相关；RBM3沉默可导致G2/M期数量增加，并促使细胞凋亡；RBM3还可提高血管内皮生长因子mRNA、COX-2的稳定与翻译，mRNA翻译变化对细胞变化、肿瘤发生起着重要作用；而且RBM3可与mRNA直接结合，起到改变mRNA二级结构的作用，影响核糖体亚基和起始因子的访问，并调节其激酶活性，影响肿瘤疾病的发生。本研究结果显示，RBM3在卵巢上皮性癌组中的阳性率明显高于卵巢良性上皮性肿瘤组和正常卵巢组织组，证实RBM3可通过改变细胞的微小RNA水平和控制球蛋白的表达水平进而影响肿瘤的进展，临床可根据RBM3水平诊断鉴别卵巢上皮性癌。

综上所述，RBM3和COX-2在卵巢上皮性癌中呈高表达，因此RBM3和COX-2可作为诊断卵巢上皮性癌的重要生物学指标。